2012免疫學(xué)實驗講義

PAGE免疫學(xué)實驗講義丁建英（供10食品質(zhì)量與安全專業(yè)用）常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院2012．11PAGE1實驗一免疫細胞和免疫器官結(jié)構(gòu)觀察一、目的要求掌握中樞淋巴組織與周圍淋巴組織的結(jié)構(gòu)。掌握胸腺、淋巴結(jié)和脾的結(jié)構(gòu)。了解T、B淋巴細胞在淋巴結(jié)和脾內(nèi)的分布。二、實驗內(nèi)容(一)胸腺肉眼觀察：本片取自動物胸腺。標本呈橢圓形，表面為染成紅色的結(jié)締組織被膜，可見不完全分隔的小葉，周圍染成深藍色者為皮質(zhì)，中央色淺者為髓質(zhì)。低倍鏡:表面有薄層結(jié)締組織構(gòu)成的被膜，被膜伸入實質(zhì)形成小葉間隔，將胸腺分成許多不完整的小葉。每個小葉分為皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分，周圍為皮質(zhì)，胸腺上皮細胞較少，胸腺細胞密集，故著色較深；小葉中央為髓質(zhì)，相鄰小葉的髓質(zhì)相互連接，胸腺細胞較少，胸腺上皮細胞較多，染色淺；髓質(zhì)中可見染成紅色的胸腺小體(thymiccorpuscle)。高倍鏡:胸腺小體是胸腺的特征性結(jié)構(gòu)，散在分布于髓質(zhì)，大小不等，有數(shù)層及十幾層扁平的上皮性網(wǎng)狀細胞呈同心圓排列而成，外周的上皮細胞較幼稚，呈新月形，細胞核明顯；近小體中心的上皮細胞較成熟，核漸退化；小體中心的上皮細胞已完全角質(zhì)化，細胞呈均質(zhì)嗜酸性染色，中心還常見巨噬細胞或嗜酸性粒細胞。（二）淋巴結(jié)（lymphnode）肉眼觀察：本片取自狗的頸部淋巴結(jié)。標本呈長橢圓形，表面為染成紅色的結(jié)締組織被膜，淋巴結(jié)實質(zhì)分為皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分。外周呈紫藍色者為皮質(zhì)，中央色淺者為髓質(zhì)，一側(cè)凹陷稱為淋巴結(jié)門部。低倍鏡:被膜：由致密結(jié)締組織構(gòu)成，有的標本可見腔大而不規(guī)則、壁薄，帶有瓣膜的輸入淋巴管。被膜伸入實質(zhì)形成小梁網(wǎng)，被膜表面可見脂肪和結(jié)締組織，可能因取材時未剝離凈。皮質(zhì)：位于被膜下方，由淺皮質(zhì)、深皮質(zhì)和皮質(zhì)淋巴竇三部分構(gòu)成。淺皮質(zhì)由薄層彌散淋巴組織及淋巴小結(jié)(lymphoidnodule)組成，淋巴小結(jié)為深紫色、排列整齊的圓形結(jié)構(gòu)，頂部及周圍有一層密集的小淋巴細胞，著色較深，稱為小結(jié)帽，中央著色較淺稱為生發(fā)中心，可分為暗區(qū)和明區(qū)兩部分，暗區(qū)位于生發(fā)中心的基部，由許多著色較深的大淋巴細胞組成，明區(qū)位于生發(fā)中心的外側(cè)，由中淋巴細胞組成；皮質(zhì)深層的彌散淋巴組織為深皮質(zhì)（胸腺依賴區(qū)）；被膜與淋巴小結(jié)之間以及淋巴小結(jié)與小梁之間的腔隙為皮質(zhì)淋巴竇，竇內(nèi)由星狀的網(wǎng)狀細胞和淋巴細胞等充填。髓質(zhì)：由髓索及其間的髓竇構(gòu)成。髓索是相互連接的索狀淋巴組織，中央可見毛細血管后微靜脈，髓竇與皮質(zhì)淋巴竇結(jié)構(gòu)相同，但較寬大。門部：在疏松結(jié)締組織內(nèi)可見血管以及形態(tài)不規(guī)則的輸出淋巴管。高倍鏡:進一步觀察皮質(zhì)和髓質(zhì)的微細結(jié)構(gòu)。深皮質(zhì)內(nèi)可見高內(nèi)皮的毛細血管后微靜脈；淋巴竇壁由扁平內(nèi)皮圍成,內(nèi)皮外為一層扁平的網(wǎng)狀細胞；竇腔中有染色淺紅的網(wǎng)狀細胞構(gòu)成支架，網(wǎng)眼中有大、中、小淋巴細胞和巨噬細胞；髓質(zhì)中還可見腔內(nèi)充滿紅細胞的血管斷面。（三）脾肉眼觀察：本片取自動物脾。標本呈橢圓形，染色不均勻，散在呈深紫藍色小點者為白髓，紅色部分為紅髓。低倍鏡:被膜：較厚，由致密結(jié)締組織構(gòu)成，表面覆以間皮，內(nèi)含散在平滑肌，被膜伸入實質(zhì)形成小梁，小梁中可見平滑肌的縱、橫切面以及血管的斷面。白髓：白髓為紫藍色，主要由淋巴細胞密集的淋巴組織構(gòu)成，分為動脈周圍淋巴鞘和淋巴小結(jié)兩部分。其中的小動脈為中央動脈，緊緊包繞中央動脈的較密集的淋巴組織為動脈周圍淋巴鞘，此區(qū)相當(dāng)于淋巴結(jié)內(nèi)的副皮質(zhì)區(qū)。在鞘的一側(cè)常常有淋巴小結(jié)，稱脾小體(spleniccorpuscle)，其結(jié)構(gòu)與淋巴結(jié)的淋巴小結(jié)相同，發(fā)育較大的淋巴小結(jié)也可見生發(fā)中心，帽部朝向紅髓。邊緣區(qū)：位于白髓和紅髓交界處，該區(qū)的淋巴細胞較白髓稀疏，但較脾索密集，并混有少量紅細胞。紅髓:位于被膜下、小梁周圍、邊緣區(qū)外側(cè)及白髓之間，由脾索和脾血竇構(gòu)成。高倍鏡：詳細觀察脾的微細結(jié)構(gòu)。被膜：表面有一層間皮覆蓋，被膜及小梁內(nèi)的平滑肌斷面更為清楚。中央動脈：是脾的結(jié)構(gòu)特征，圍繞在動脈周圍的厚層彌散淋巴組織稱動脈周圍淋巴鞘。紅髓：脾索為富含血細胞的索狀淋巴組織，在血竇之間相互連接成網(wǎng)，以網(wǎng)狀組織為支架，內(nèi)含淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞及各種血細胞，但紅細胞較少。脾索間的腔隙為脾血竇，形態(tài)不規(guī)則，在血竇的橫切面上，可見桿狀內(nèi)皮細胞沿血竇壁呈點狀排列，胞核突向竇腔，腔內(nèi)含有各種血細胞。三、實驗報告繪淋巴結(jié)皮質(zhì)、髓質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。實驗二、凝集試驗血型鑒定試驗一、實驗?zāi)康?、熟悉直接凝集試驗的原理。2、了解直接凝集試驗及在血型鑒定的應(yīng)用。二、實驗原理人類血型是以紅細胞膜上所含凝集原的不同而分型。紅細胞膜上含有A凝集原為A型，血清中含有B凝集素;紅細胞膜上含有B凝集原為B型，血清中含有A凝集素;紅細胞膜上含有A.B凝集原為AB型，血清中無凝集素;紅細胞膜上無A.B凝集原為O型，血清中含有A.B凝集素.用抗A和抗B兩種標準血清，與紅細胞進行直接凝集反應(yīng)，鑒定出A型、B型、AB型、O型4種不同的血型。表1不同血型中紅細胞膜上所含凝集原與血清中所含凝集素血型紅細胞內(nèi)所含凝集原血清中所含凝集素O-α+βAAβBBαABA+B-玻片法：（一）實驗器材1、抗A血清（標記紅色）和抗B（標記綠色）標準血清;2、采血針、雙凹玻片、碘酒、酒精、棉球（棉簽）。（二）實驗方法1、取清潔雙凹玻片，用記號筆在左角上注抗A字，右角上注看B字；2、以碘酒、酒精棉球消毒指端皮膚，針刺受檢者指端；3、在雙凹玻片內(nèi)各加血1滴后，在抗A字端加抗A標準血清1滴，在抗B字端加抗B標準血清1滴；4、晃動玻片混勻，待3~5分鐘后（中間傾斜玻片數(shù)次觀察結(jié)果或用低倍鏡觀察），觀察凝集現(xiàn)象，按下表報告血型結(jié)果。（三）結(jié)果判斷表2血型結(jié)果判斷血型凝集現(xiàn)象抗B標準血清（含β凝集素）抗A標準血清（含α凝集素）O--A-+B+-AB++[注意事項]1、用碘酒與酒精認真消毒采血部位；2、勿用力擠壓采血部位防止紅細胞溶解，防止血液凝固；3、應(yīng)在1~3min內(nèi)觀察結(jié)果。試管法：（一）實驗器材1、抗A血清（標記紅色）和抗B（標記綠色）標準血清;2、采血針、碘酒、酒精、棉球（棉簽）、潔凈小試管、毛細吸管、水浴箱（二）實驗步驟1、取潔凈小試管兩支，分別注明“A”、“B”字樣，用毛細吸管滴加抗A血清2滴于A管中，抗B血清滴于B管中。2、兩管中各加待測紅細胞懸液2滴，充分搖均，置于室溫或水浴箱30分鐘后，觀察結(jié)果，或放置離心機中，1000rpm低速離心1分鐘，然后觀察結(jié)果。（三）實驗結(jié)果判斷觀察結(jié)果時，可將試管斜持，輕搖沉淀血塊觀察有無凝集塊，若不清可在低倍鏡下觀察。實驗三、雙向瓊脂擴散實驗一、實驗?zāi)康?、掌握雙向瓊脂擴散試驗的原理。2、熟悉雙向瓊脂擴散試驗的操作方法。二、實驗原理

雙向瓊脂擴散實驗，是將抗原和相應(yīng)抗體分別加入同一凝膠板內(nèi)的相鄰小孔中。兩者相互擴散,當(dāng)擴散到他們的濃度比例合適的部位相遇時,就會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀。三、實驗器材玻璃板、乙醇、血清、抗血清

四、實驗步驟

1.取一塊干凈的玻璃板，用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水平臺，將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫。

2.將瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚度約為1㎜。

3.打孔，孔距為4㎜。

4.將抗血清按二倍稀釋法稀釋成1:2,1:4,1:8,1:16,1:32的不同濃度。

5、在周圍孔中加入不同濃度的抗體，中心孔加抗原。

將凝膠板置于濕盒內(nèi)，室溫過夜，觀察結(jié)果。

五、實驗結(jié)果觀察

濃度不同，形成不同的沉淀的線。雙向瓊脂擴散原抗體孔位置示意圖實驗四、沉淀試驗一、實驗?zāi)康?、掌握沉淀試驗的原理。2、熟悉沉淀試驗的操作方法。二、實驗原理將抗原與抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合，形成絮狀沉淀物。這種沉淀試驗受到抗原和抗體比例的直接影響，因而產(chǎn)生了兩種最適比例的基本測定方法。三、實驗器材（1）免疫血清：免疫兔抗人血清；（2）抗原：人血清；（3）小沉淀管、毛細吸管、橡皮頭、生理鹽水。四、實驗方法：（1）取小沉淀管2只，以毛細吸管吸取抗人血清約0.2毫升，加入第一管，加時注意不能有氣泡；（2）以毛細吸管吸取生理鹽水0.2毫升加入第二管；（3）用毛細吸管吸入血稀釋0.2毫升加入各管，加時應(yīng)注意使抗原溶液緩緩由管壁流下，輕浮于血清面上，使成一明顯界面，切勿使之相混；（4）置室溫中10—20分鐘，觀察液面有無乳白色沉淀環(huán)，若有則為陽性。實驗五、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）一、實驗?zāi)康?、掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理。2、熟悉乳品中黃曲考霉毒素M1測定前處理和酶聯(lián)免疫法測定的操作方法。二、實驗原理標準溶液和樣品試液加入各自板孔，游離的黃曲霉毒素M1與微孔中包被的黃曲霉毒素M1抗體結(jié)合，沒有結(jié)合的物質(zhì)在洗滌中被清除。再加入黃曲霉毒素M1酶標記物，將沒有結(jié)合的抗體位點全部覆蓋，結(jié)合的酶標記物通過顯色液顯示出來。最后加入終止液，用酶標儀在450nm測定吸光度值，吸光度值與樣品中的黃曲霉毒素M1含量成反比。三、實驗器材1、試劑：本實驗所用試劑均為分析純，水為去離子水。黃曲霉毒素M1試劑盒：最低檢出限不大于0.02μg/kg。微孔板。黃曲霉毒素M1標準溶液：濃度范圍0～0.10μg/kg。酶標記物濃縮液。酶標記物稀釋用緩沖液。顯色劑。檸檬酸緩沖液。終止液。樣品稀釋緩沖液。洗板濃縮液。酶標記物工作液：實驗前計算用量，用酶標記物稀釋用緩沖液將其濃縮液以1：100稀釋，切勿渦旋混合，配制后放回試劑盒放置4h以上，備用。顯色反應(yīng)液：顯色劑用檸檬酸緩沖液以1：10稀釋，在使用前配制，避光保存。洗板工作液：洗板濃縮液用水以1：20稀釋，備用。0.36mol/L亞鐵氰化鉀溶液：稱取15.2gK4[Fe(CN)6]·3H2O，用水溶解、定容至100mL。1.04mol/L硫酸鋅溶液：稱取29.9gZnSO4·7H2O,用水溶解、定容至100mL。儀器和設(shè)備微孔板酶標儀（帶450nm濾光片）。天平：最小感量0.冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速不小于3000rpm。旋渦混合器。連續(xù)可調(diào)移液器及配套吸頭：5μL～50μL、20μL～200μL、200μL～1000μL。脫脂棉簽。實驗室常規(guī)玻璃器皿。分析步驟1、樣品前處理（1）生鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳[以下簡稱液態(tài)乳]：將待測樣品搖勻，平行稱取兩份5.0g試樣（精確到0.1g）到10mL離心管中，2oC～8oC以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，用脫脂棉簽除去上層脂肪。加入150μL亞鐵氰化鉀溶液（4.5），短暫渦旋混合后加入150μL硫酸鋅溶液（4.6），渦旋振蕩3min。10oC～15oC以3000（2）乳粉：平行稱取兩份10.0g待測乳粉（精確到0.1g）到各自小燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，定容至刻度。以下步驟同62、測試程序以下操作均須在20oC～25oC溫度下進行。（1）取出試劑盒，放置1h以上，使其溫度恢復(fù)到20oC～25oC。將足夠標準和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，并記錄標準和樣品對應(yīng)的位置。（2）加100μL標準溶液（4.（3）倒除微孔中的液體，注入洗板工作液（4.4）約300μL，重復(fù)洗滌5次，最后在吸水紙上輕輕拍干。（4）在所有微孔中加入100μL酶標記物工作液（4.2），孵育20min。重復(fù)（3）步驟。（5）在所有微孔中加入100μL顯色反應(yīng)液（4.3），孵育30min。（6）在所有微孔中加入50μL終止液（4.五、結(jié)果計算和表述標準工作曲線繪制以標準溶液的濃度值（C）為橫坐標，相對吸光度值（B/B0）為縱坐標，在半對數(shù)坐標紙上繪制標準工作曲線。相對吸光度值（%）=B/B0×100(1)式中：B——標準（或樣品）的吸光度值；B0——空白（濃度為0的標準溶液）的吸光度值。2、結(jié)果計算（1）液態(tài)乳中黃曲霉毒素M1的含量按式（2）計算：X1=k1·Cx(2)式中：X1——液態(tài)乳中黃曲霉毒素M1的含量，μg/kg；k