PCR體系優(yōu)化(新)課件

熒光PCR體系的優(yōu)化及多色熒光PCR程揚健廈門大學生命科學院分子診斷實驗室1精選2021版課件認識它們嗎？！2精選2021版課件什么是Ct值和Δ

Rn？Ct值中的C代表循環(huán)數(shù)（Cycle），t代表域值（threshold），Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Δ

Rn:相對熒光強度Ct(S/B)3精選2021版課件為什么用Ct值定量而不用終點相對熒光強度定量4精選2021版課件實時熒光PCR是如何定量？利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值（如圖所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。在一定范圍:Ct值∝1lgC5精選2021版課件PCR檢測過程樣品處理PCR擴增結(jié)果檢測RealtimePCR6精選2021版課件實時熒光定量PCR優(yōu)化目標1、Ct值2、ΔRn值3、R值7精選2021版課件優(yōu)化內(nèi)容引物設計和篩選

探針設計和篩選反應體系的優(yōu)化反應程序的優(yōu)化

HCV分子信標8精選2021版課件引物的設計與篩選1序列查找與比對9精選2021版課件附：主要數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址數(shù)據(jù)庫組織網(wǎng)址MEDLINENationalLibraryofMedicine

GenBankNationalCenterforBiotechnologyInformationEMBLEuropeanBioinformaticsInstitutewww.ebi.ac.uk

DDBJNationalInstituteofGenetics,Japanwww.ddbj.nig.ac.jp

SWISS-PROTSwissInstitutesofBioinformaticswww.expasy.ch

PIRNationalBiomedicalResearchFoundationPRFProteinResearchFoundation,Japanwww.prf.or.jp

PDBResearchcollaboratoryforStructuralbioinformatics

CSDCambridgeCrystallographicDataCenterwww.ccdc.cam.ac.uk10精選2021版課件二級結(jié)構(gòu)分析條件：42℃；50mMNa+;2.5mMMg2+/~zukerm/rna/引物的設計與篩選211精選2021版課件HCV5’

UTR引物設計5’3’HCV引物的設計與篩選312精選2021版課件引物篩選結(jié)果12345引物的設計與篩選413精選2021版課件引物用量的優(yōu)化不對稱PCR（S/A=1：4）Vs對稱PCR（S/A=1：1）引物的設計與篩選514精選2021版課件探針設計和篩選1探針設計15精選2021版課件探針設計和篩選2探針的Tm值16精選2021版課件＋探針設計和篩選3退火溫度的確定17精選2021版課件探針用量的優(yōu)化0.6uM0.3uM0.15uM探針設計和篩選418精選2021版課件不同TaqE的比較Taq1Taq2反應體系的優(yōu)化119精選2021版課件TaqE濃度的優(yōu)化0.5U/T1.0U/T2.0U/T3.0U/T反應體系的優(yōu)化220精選2021版課件dNTP濃度的優(yōu)化20uM/T10uM/T40uM/T80uM/T反應體系的優(yōu)化321精選2021版課件Mg2+對熒光強度的影響22精選2021版課件Mg2+和退火溫度的優(yōu)化

--------(方陣法）

23精選2021版課件PCR促進劑的影響

24精選2021版課件AMV與M-MLV的比較M-MLVAMV25精選2021版課件M-MLV的用量的優(yōu)化WellCtF1 27.373F2 30.291F5 26.144F6 29.143G1 26.205G2 29.896G5 26.221G6 29.661H2 26.279H3 29.854H4 0.00010u/test20u/test30u/test40u/test50u/testNTCF6F526精選2021版課件高濃度RNA低濃度RNA比較了四個濃度：24U/T12U/T

8U/T4U/TRNA酶抑制劑濃度的優(yōu)化27精選2021版課件成分作用優(yōu)化前濃度優(yōu)化后濃度上游引物DNA正鏈擴增引物0.15uM0.15uM下游引物RNA逆轉(zhuǎn)錄和DNA負鏈擴增引物0.15uM0.6uM探針與模板雜交，發(fā)送信號0.15uM0.6uMTaq酶合成雙鏈DNA1.2U/T2U/TdNTP為模板復制提供原料20uM/T20uM/T鎂離子支持Taq酶活性1.5mmol2.5mmol逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA30U/T20U/TRNA酶抑制劑防止RNA降解12U/T12U/T擴增緩沖液提供穩(wěn)定的反應環(huán)境pH8.6pH8.6優(yōu)化前后含量對比28精選2021版課件逆轉(zhuǎn)錄時間的比較逆轉(zhuǎn)錄時間（30min；45min；60min）45min反應程序的優(yōu)化29精選2021版課件RT-PCR擴增程序優(yōu)化RT-PCR擴增程序（優(yōu)化前）42度，60分鐘95度，3分鐘95度，30秒55度，20秒逆轉(zhuǎn)錄預變性延伸RT-PCR擴增程序（優(yōu)化后）42度，45分鐘95度，3分鐘95度，10秒58度，45秒逆轉(zhuǎn)錄預變性50個循環(huán)45個循環(huán)72度，20秒退火變性退火延伸反應程序的優(yōu)化變性30精選2021版課件優(yōu)化前后的比較優(yōu)化后優(yōu)化前31精選2021版課件多色熒光PCR雙色熒光PCR三色熒光PCR多色熒光PCR32精選2021版課件多色熒光PCR的特點①高效性，在同一PCR反應管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體.②系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細菌及細菌戰(zhàn)劑的同時偵檢.③經(jīng)濟性，多種病原體在同一反應管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息.

33精選2021版課件雙色熒光PCR不加內(nèi)標（單色PCR)加人內(nèi)標(雙色PCR）FAMJOE34精選2021版課件三色熒光PCRFAMHEXTexas