人源化抗體：構建的核心原則與策略

人源化抗體：構建的核心原則與策略第一代人源化抗體是通過將鼠源McAb的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)相結合，形成了一種嵌合抗體。盡管這兩部分在空間結構上相對獨立，使得其獨特的抗原親和力得以保持，但由于嵌合抗體中仍然包含鼠源McAb的可變區(qū)，因此在應用時仍可能引發(fā)強烈的HAMA反應。為了克服這一問題，科學家們進一步進行了改進，將鼠源McAb可變區(qū)中的相對保守的骨架區(qū)（Frameworkregion,FR）替換為人的FR，而僅保留抗原結合部位的互補決定區(qū)（Complementarity-Determiningregion,CDR）。這種改進使得抗體真正實現(xiàn)了人源化。然而，F(xiàn)R作為抗體的腳手架，不僅為CDR提供了空間構象環(huán)境，有時還參與抗體結合位點正確構象的形成，甚至與抗原的結合。因此，簡單的CDR移植往往會導致原抗體親和力的喪失或降低。為了解決這一問題，目前科學家們已經(jīng)探索出了四種策略，旨在優(yōu)化FR和CDR之間的相互作用，以恢復或提高人源化抗體的親和力。這些策略的實施將有助于進一步提升抗體人源化的效果，為醫(yī)學研究和治療提供更多的可能性。人源化抗體構建原則與策略1.模板替換在使用與鼠對應部分有較大同源性的人抗體FR替換鼠FR時，通常有兩種途徑可供選擇。第一種途徑是采用同一個（或少數(shù)幾個）具有已知晶體結構數(shù)據(jù)的人源抗體可變區(qū)框架（如VH中的NEW、KOL，VL中的REI等）作為基本模板，通過序列比較與分子模建，確定人、鼠間存在種源差異的氨基酸殘基，特別是與鼠CDR密切作用的氨基酸殘基，在替換過程中予以保留。為了確保CDR的空間構象得以維持，需要特別關注原來抗體CDR下方的堆積殘基以及周圍的殘基。這種方法的優(yōu)勢在于，已知的人源FR晶體結構為殘基替換提供了明確的信息。然而，其不足之處在于可能難以保持鼠CDR的天然構象，從而可能導致抗體親和力的降低或喪失。第二條途徑是在已有的抗體序列庫中搜索與鼠McAbFR具有最大同源性的人源FR進行替換。在選擇同源的人FR時，早期的研究者傾向于將VL和VH作為一個整體來考慮，以尋找最高同源的人FR，理由是同一個抗體的VL和VH在折疊上更能匹配。然而，后來的研究者則認為將VL和VH分開考慮，分別尋找最高同源的對應序列，可以更好地保持FR原來的框架，為鼠CDR提供整體上最類似的環(huán)境。同源替換的主要考慮因素是確保鼠CDR在此背景下具有類似的折疊環(huán)境，從而維持其原來的構象。同樣需要借助分子模建來提供CDR移植后可能缺失的FR關鍵殘基的信息。這種方法的優(yōu)點在于能夠減少需要更改的氨基酸數(shù)目，更好地保持CDR所需的空間環(huán)境。然而，其不足之處在于選擇的人源FR可能并無結構數(shù)據(jù)可供參考，因此無法提供有效的關鍵殘基信息。2.表面重塑對鼠CDR及FR的表面殘基進行鑲飾（veneering）或重塑（resurfacing），以使其輪廓（profile）或型式（pattern）更加類似于人抗體的CDR或FR。這一策略的前提是，鼠McAb可變區(qū)的免疫原性主要源自其表面殘基。由于殘基的運動性和溶液可及性是成為抗原決定簇的關鍵因素，因此表面殘基很可能攜帶全部或絕大部分的抗原表位。在定義溶液可及性表面殘基時，我們采用的標準是：構成該殘基的全部原子的30%以上是溶劑可及的。盡管人、鼠間抗體可變區(qū)表面暴露殘基的精確型式存在差別，但大多數(shù)表面位置的殘基類別具有強烈的傾向性。僅僅考慮這種表面型式，我們就可以區(qū)分抗體可變區(qū)的不同組別。這表明抗體可變區(qū)的表面至少與框架區(qū)核心一樣保守，而表面型式的差異則是人鼠間抗體的主要區(qū)別。根據(jù)對現(xiàn)有抗體晶體結構數(shù)據(jù)的分析結果統(tǒng)計，人、鼠間抗體可變區(qū)殘基在序列配對位置上的相對溶劑可及性分布保真度高達98%。這意味著在異種間誘導免疫反應的殘基是由其余的種特異性溶液可及表面殘基引起的。通過將鼠特異性表面殘基替換為人源性的殘基，我們可以模擬人源抗體的表面輪廓，從而逃避人體免疫系統(tǒng)的識別，達到人源化的目的。這種策略可以在不進行同源模建的情況下，基于序列同源分析，選擇與鼠表面殘基暴露類型最相匹配的人源型式進行。然而，需要注意的是，如果要改變的殘基在側鏈大小、電荷、疏水性或有可能形成氫鍵從而影響到CDR的構象時，則不應進行改變。這是因為改變的殘基較少，有助于減少CDR-FR之間的不相容性。作為一種較新的人源化途徑，該策略仍在逐步成熟階段。關于鼠源McAb在人體引起的HAMA反應是否完全由其表面暴露殘基引起，還是由表面殘基與內(nèi)部殘基的共同貢獻所致，這涉及到抗體產(chǎn)生最基本的免疫學機制，目前仍是研究的熱點。通過深入探索這一策略，我們有望為抗體人源化提供更多有效的解決方案。3.補償變換在選擇人FR進行改變時，我們重點關注那些與CDR有相互作用、與抗體的親和力有密切關系或?qū)R空間結構折疊起關鍵作用的殘基。這些改變旨在補償完全的CDR移植可能帶來的影響。根據(jù)立體結構數(shù)據(jù)和同源性分析，我們了解到在抗原結合、穩(wěn)定CDR構象和FR折疊方面，構成抗體FR的殘基并不具有相同的重要性?；谶@一點，我們可以將這些殘基分為三類：低風險性殘基，這些殘基暴露于溶劑中，對抗原結合和抗體結構的貢獻較少。替換這些位置的殘基可以降低免疫原性，而幾乎不影響抗體的親和力；高風險性殘基，這些殘基直接參與抗原結合、穩(wěn)定CDR構象或FR折疊。為了保持人源化抗體的活性，我們應盡量避免在這些位置進行替換；中度風險性殘基，對于這類殘基，我們需要謹慎處理。FR中的高風險性殘基和某些中度風險性殘基，統(tǒng)稱為非CDR區(qū)補充調(diào)控殘基。它們分布于線性序列的不同位置，為每個CDR回折提供了合適的“平臺”。這些殘基的形狀和側鏈大小協(xié)同決定了CDR的基本構象，并影響其抗原結合的特異性。因此，在將CDR移植到人源FR后，我們必須將人FR中的這些位置替換成鼠源非CDR區(qū)補充調(diào)控殘基，以補償完全的CDR移植帶來的影響。這種分析方法使我們能夠制定具有選擇性和針對性的人源化突變方案，避免了盲目的、可能導致失敗的探索。此外，通過在中度風險性殘基中進行變化，我們還有可能提高人源化抗體的親和力。然而，需要注意的是，對殘基的分類需要基于晶體數(shù)據(jù)和三維結構，以確保提供準確的標準。4.定位保留(positionalconsensusmethod)人源化McAb保留了鼠源McAb可變區(qū)中參與抗原結合的關鍵氨基酸殘基，這包括了CDR以及FR中的一些至關重要的殘基。盡管我們可以將鼠框架區(qū)的其余部分從某個人FR中移植過來，但無可避免的是，這樣得到的人源化抗體序列與人抗體的保守序列（consensussequences）在某些位置上仍會存在差異。這些非典型殘基，源自個體型抗體在親和力成熟過程中的體細胞突變，應用于病人后可能會誘導免疫反應。因此，一個更為理想的途徑是，以人FR的保守序列為模板進行人源化設計。由于人抗體輕、重鏈可變區(qū)不同亞類的保守序列存在差異，我們需要尋找一種合適的方法來確定最適合的保守序列。最簡位置模板（minimalpositionaltemplate）為我們提供了確定這些關鍵位置的方法，它揭示了抗體可變區(qū)中哪些位置對于維持抗原結合結構域的完整性是絕對必要的。在選擇人框架區(qū)時，我們首先會從現(xiàn)有的人源抗體保守序列中搜尋與鼠框架區(qū)最為類似的序列。接著，根據(jù)最簡位置模板，我們確定鼠可變區(qū)的關鍵位置殘基。最后，我們將保留所有這些關鍵位置，而將其余部分進行人源化改造。上述人源化的四種策略，均以保持抗體的親和力為核心目標，以降低免疫原性為最終目的，各具特色?？偟膩碚f，抗體人源化設計的關鍵步驟包括：①從同源抗體或共同序列抗體中選擇適合的人源FR。②根據(jù)已發(fā)