TNAIA 0262-2023 牛場(chǎng)牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）基因分型與防制

ICSICS65.020.30ICSCCSA031

T/NAIA團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/NAIA0262-2023牛場(chǎng)牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）基因分型與防制Technicalregulationsforgenotypingandpreventionofbovineviraldiarrheavirus(BVDV)incattlefarms2023-12-18發(fā)布 2023-12-31實(shí)施寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì) 發(fā)布T/NAIA0262-2023T/NAIA0262-2023前言GB/T1.1-20201定起草。本文件由寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)提出并歸口。所。本文件主要起草人：王建東、高閃電、于有利、郭亞男、梁小軍、王曉亮、許立華、李知新、宣小龍、施安、康曉冬、高海慧、張久盤、孟茹、李志、付永、郭慧琛、邵軍軍、劉偉、?；菔|、周廣青。牛場(chǎng)牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）基因分型與防制范圍本文件規(guī)定了牛場(chǎng)牛病毒性腹瀉病毒預(yù)防和凈化。本文件適用于牛場(chǎng)中奶牛、肉牛等?？苿?dòng)物的牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）RT-PCR基因分型與防制。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 動(dòng)物檢疫農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]25號(hào)病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。BovineViralDiarrheaVirus牛病毒性腹瀉病/黏膜病是由牛病毒性腹瀉病毒引發(fā)牛的一種傳染病，臨床上以發(fā)熱、腹瀉、呼吸道癥狀、出血綜合征、黏膜糜爛、白細(xì)胞減少、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)畸型胎為主要特征。RT-PCRRT-PCRgenotyping即利用分子生物學(xué)方法，對(duì)其基因進(jìn)行分型的技術(shù)。流行病學(xué)爛 爛內(nèi)始終帶毒，是牛群中最危險(xiǎn)的傳染源。RT-PCR基因分型樣品采集用無菌注射器直接采集血液或者抗凝血至滅菌離心管，或使用獸用采血針、真空無菌采血管、真空無菌抗凝管采血管，采集全血或抗凝全血，編號(hào)備用。樣品處理血清處理25℃～37℃靜置30min～45轉(zhuǎn)速8000rpm離心10min或4000rpm離心30min，用移液槍把血清移入儲(chǔ)存管備用。全血處理使用抗凝枸櫞酸葡萄糖（ACD）為抗凝劑。利用滅菌離心管收集血液時(shí)，加入1/6體積的ACD抗凝劑，充分混勻；利用商品化EDTA抗凝采血管收集血液時(shí)，直接收集血液并混勻即可。RNA提取n個(gè)無RNAse600μLTrizol別加入100μL待檢血清或抗凝血，充分混勻后加入200μL氯仿，充分顛倒混勻；于4℃、12000g心15RNAse0.5mL12000離心10min；棄上清，加入1mLDEPC水配制的冰冷75%乙醇充分洗滌沉淀；4℃、12000g離心min，棄上清，12000g離心10s，吸去殘存的液體，室溫風(fēng)干3min，加入適量（20～25μL）DEPC水溶解，直接用于檢測(cè)或-80℃保存。基因分型套式RT-PCR參考文獻(xiàn)中的引物，套式PCR引物序列，PCR反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序見表1-3。表1 巢氏PCR引物序列引物名稱引物序列（5’-3’）擴(kuò)增片段（bp）PanBVDVpcrFCTCTGCTGTACATGGCACATG1005PanBVDVpcrRTTCTCACTNGCRTCCATCATBVDV-1npcrFTTTCAAGCTGCTCHGAYAC505BVDV-2npcrFATCCTGACCAATGCTAGGTCC′833BVDV-3npcrFTCCTGTGGCAACCGGTAGGT211表2 PCR反應(yīng)體系體系成分 用量（μL）2XStepBuffer 12.51XStepEnzymeMix 1上游引物 1下游引物 1DEPC水 7.5RNA模版 2合計(jì) 25表3 PCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間循環(huán)次數(shù)第一輪巢氏PCR50℃30min194℃2min194℃30s55℃30s3572℃1min72℃10min14℃∞1第二輪巢氏PCR98°C10s55°C30s3072°C1min72℃10min14℃∞1RT-PCR參考文獻(xiàn)中的引物，在一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)BVDV-1和BVDV-2，在另一反應(yīng)管中對(duì)BVDV-3單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)。爛 爛BVDV-1BVDV-2分型檢測(cè)BVDV-1和BVDV-2的引物為PestiF5'-CTAGCCATGCCCTTAGTAG-3PestiR5'-CGTCGAACCAGTGACGACT-3'。探針為BVDV-1P：FAM-TAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCT-BHQ，BVDV-2P：TxR-TAGCGGTAGCAGTGAGTTCGTTGGATGGCC-BHQ。根據(jù)表4反應(yīng)體系和表5反應(yīng)程序進(jìn)行RT-PCRBVDVRNA的存在與否以及BVDV通道的擴(kuò)增曲線表示BVDV-1陽性，TxR（ROX）通道擴(kuò)增曲線表示BVDV-2陽性）。表4 BVDV-1型和BVDV-2型RT-PCR反應(yīng)體系體系成分 用量（μL）2XOneStepRT-PCRBuffer 12.5ExTaq 0.5反轉(zhuǎn)錄酶 0.5PestiF/BVDV-1P 0.5PestiR/BVDV-2P 0.5ROXReferenceDyeorDyeⅡ 0.5DEPC水 8.5RNA 1合計(jì) 25表5 BVDV-1型和BVDV-2型RT-PCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度 反應(yīng)時(shí)間 循環(huán)次數(shù)42℃ 5min 195℃ 10s 195℃ 5s60℃ 30s 40BVDV-3分型檢測(cè)BVDV-3的引物為T34F：5'-GACTAGTGGCAGTGAGC-3'T220R：5'-GAGGCATTCCTTGATGCGTC-3'BVDV-3P:5'-FAM-ACTCGGGGCTTCGGTGATCCAGGG-BHQ-3'。根據(jù)表6反應(yīng)體系和表5反應(yīng)程序進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定樣品中BVDV-3RNA存在與否（FAM通道擴(kuò)增曲線表示BVDV-3陽性）。表6 BVDV-3型RT-PCR反應(yīng)體系體系成分 用量（μL）2XOneStepRT-PCRBuffer 12.5ExTaq 0.5反轉(zhuǎn)錄酶 0.5T34F（10μM） 0.5T220R（10μM） 0.5BVDV-3P（10μM） 0.25ROXReferenceDyeorDyeⅡ 0.5DEPC水 8.5RNA 1BVDV

合計(jì) 25基于BVDVN基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，顯示從寧夏地區(qū)奶牛場(chǎng)分離鑒定的BVDV亞型主要包括BVDV-1a（YC2、QTX1）、BVDV-1d（QTX5）、BVDV-1m（YC3、QTX4、QTX6、QTX7、QTX9）、BVDV-1q（QTX8）以及BVDV-2型，系統(tǒng)發(fā)育樹見附錄C.1。BVDV防治方法加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理做好動(dòng)物免疫接種免疫接種利于預(yù)防牛病毒性腹瀉病毒感染。牛6~10個(gè)月大時(shí)，從初乳中獲得的母源抗體水平變?nèi)?，此時(shí)接種減毒與滅活疫苗利于有效預(yù)防?；疾《拘愿篂a病毒。做好凈化爛 爛由于前期標(biāo)準(zhǔn)制定者已明確我區(qū)目前流行BVDV-1a、BVDV-1d、BVDV-1m、BVDV-1q以及BVDV-2型，并且BVDV-1a、BVDV-1m和BVDV-2毒株在寧夏地區(qū)是首次分離鑒定的，要每年定期檢測(cè)，做到第一次抗原陽性，時(shí)間間隔60天后復(fù)測(cè)為陽性的牛要進(jìn)行淘汰。重視飼養(yǎng)管理對(duì)牛群加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，為牛提供充足且均衡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，全面提高牛只免疫力，降低牛病毒性疾病發(fā)病率。合理選用治療方法當(dāng)前，BVDV感染還沒有特效治療方法。生產(chǎn)過程中常以對(duì)癥治療方法控制病情，其中收斂劑菌感染，造成大面積死亡。附錄A（資料性）溶液配制以下所用試劑均為分析純。抗凝枸櫞酸葡萄糖（ACD）為抗凝劑稱取檸檬酸0.48g1.32g1.47g溶于100mL121℃高壓滅菌30冷卻后分裝備用。DEPC水在通風(fēng)櫥中，將DEPC加入去離子水（符合GB/T6682）中至終濃度為0.1%，充分作用12h。121℃高壓滅菌30min，冷卻后分裝備用。50×TAE貯存液Tris堿 242.0g冰醋酸 57.1mLEDTA（0.5mol/L，pH8.0） 100.0mL加蒸餾水定容至1000mL，在1.034×105Pa壓強(qiáng)下蒸汽滅菌20min，使用時(shí)用蒸餾水稀釋成1×TAE。1.0%瓊脂糖凝膠1g1×TAE100mL55℃濃度的核酸染料，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，凝固后移去樣品梳，當(dāng)天使用。爛 爛附錄B（資料性）BVDV分型RT-PCR結(jié)果電泳示意圖及熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線示意圖BVDV分型RT-PCR結(jié)果電泳圖見圖B.1，BVDV分