規(guī)?；膛霾剪斒暇艋夹g(shù)規(guī)范

1DB13/Txxxx—2022規(guī)?；膛霾剪斒暇艋夹g(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了規(guī)?；膛霾剪斒暇〉脑\斷、檢測凈化、生物安全等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于規(guī)?；膛霾剪斒暇〉膬艋渌愋偷哪膛霾剪斒暇艋蓞⒖紙?zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4143牛冷凍精液GB7959糞便無害化衛(wèi)生要求GB16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GB16568奶牛場衛(wèi)生規(guī)范GB18596畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646-2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)NY/T34奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1567標(biāo)準(zhǔn)化奶牛場建設(shè)規(guī)范NY/T1952動(dòng)物免疫接種技術(shù)規(guī)范NY5030無公害食品畜禽飼養(yǎng)獸藥使用準(zhǔn)則NY5045無公害食品生鮮牛乳NY5047無公害食品奶牛飼養(yǎng)獸醫(yī)防疫準(zhǔn)則NY/T5049無公害食品奶牛飼養(yǎng)管理準(zhǔn)則《畜禽標(biāo)識與養(yǎng)殖檔案管理辦法》（2006年農(nóng)業(yè)部令第67號）《動(dòng)物防疫條件審查辦法》（2010年農(nóng)業(yè)部令第7號）《乳用動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)》（2008年農(nóng)業(yè)部公告第1137號）《種用動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)》（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）《奶牛標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)辦牧[2008]第3號）《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2007]12號）《動(dòng)物疫病凈化場評估技術(shù)規(guī)范》（疫控監(jiān)函[2021]156號）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1規(guī)?；膛鼍哂歇?dú)立封閉的飼養(yǎng)管理區(qū)，成母牛存欄在100頭以上，取得《動(dòng)物防疫條件許可證》，管理規(guī)范的奶牛場。3.2凈化標(biāo)準(zhǔn)（非免疫）連續(xù)2年以上無布魯氏菌病臨床病例，布魯氏菌抗體檢測陰性；具備維持凈化狀態(tài)的生物安全及管理?xiàng)l件。3.3生物安全為阻止動(dòng)物病原體場外傳入、場內(nèi)傳播和向場外擴(kuò)散所需的一系列設(shè)施和措施。4實(shí)驗(yàn)室檢測方法4.1血清學(xué)檢測4.1.1檢測血清樣品虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT試管凝集試驗(yàn)（SAT間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（i-ELISA競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（c-ELISA補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT見國標(biāo)GB/T18646-2018。被檢血清來自布魯氏菌病非免2DB13/Txxxx—2022疫奶?；蚴褂肁19疫苗皮下注射超過18個(gè)月或使用S2疫苗口腔噴服接種超過6個(gè)月的奶牛。4.1.2檢測乳樣全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT見國標(biāo)GB/T18646-2018。被檢乳樣為新鮮全乳或混合乳，來自的奶牛同4.1.1，但不得為初乳、脫脂乳、煮沸過的乳、凍結(jié)乳、腐敗乳、酸化乳、乳房炎及其他乳房疾病患病牛的乳樣。4.1.3免疫血清抗體與自然感染血清抗體鑒別檢測瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（NH-GD見附錄A。4.2病原學(xué)檢測4.2.1樣品采集流產(chǎn)胎兒可無菌采集胎衣、羊水、肝、脾、淋巴結(jié)、胃內(nèi)容物等；流產(chǎn)母?？蔁o菌采集乳汁、陰道分泌物等。剖檢采樣過程應(yīng)當(dāng)防止病原微生物擴(kuò)散，操作人員應(yīng)當(dāng)采取針對性防護(hù)措施。4.2.2檢測方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR見國標(biāo)GB/T18646-2018。5診斷5.1病例診斷對流產(chǎn)母牛、流產(chǎn)胎兒，采用4.2.2檢測結(jié)果陽性的,判定為病例。5.2感染判定5.2.1對臨床健康奶牛，采用RBT或i-ELISA、MRT中任一方法，檢測結(jié)果陽性的判為疑似感染陽性。5.2.2對臨床健康奶牛，采用SAT、c-ELISA、CFT中任一方法檢測結(jié)果陽性的，判為感染陽性。5.2.3對免疫布魯氏菌病疫苗未超過4.1.1接種時(shí)間的臨床健康奶牛，采用4.1.3檢測結(jié)果陽性的，判為感染陽性。6檢測凈化6.1感染狀況調(diào)查按照奶?？偞鏅跀?shù)、預(yù)期感染率3%、置信度95%確定抽樣數(shù)量，并根據(jù)泌乳牛、干乳牛、后備牛存欄數(shù)量按比例分配，覆蓋到每個(gè)棟舍隨機(jī)抽樣，同時(shí)兼顧不同奶牛品種。采用i-ELISA或RBT方法檢測，掌握牛群布魯氏菌病感染率。6.2確定凈化技術(shù)路線6.2.1牛群布魯氏菌病感染率<2%，禁止或停止免疫。全群循環(huán)檢測，隔離淘汰患病?；蚋腥娟栃耘?。6.2.2牛群布魯氏菌病感染率≥2%，可按6.3接種布魯氏菌疫苗，跟蹤檢測感染率<2%后按6.2.1執(zhí)行。6.3免疫程序6.3.1A19疫苗。3月齡~8月齡犢牛使用密閉式連續(xù)注射器皮下注射接種一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劑量（6×1010CFU感染嚴(yán)重牛群可在首次配種前減量（6×109CFU）接種加強(qiáng)免疫一次。6.3.2S2疫苗。3月齡~8月齡犢牛使用密閉式投藥器口腔噴服接種一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劑量（5×1010CFU間隔1個(gè)月~2個(gè)月加強(qiáng)免疫一次；不建議成年牛接種。6.4檢測方法組合6.4.1串聯(lián)檢測。對于感染率≥2%的奶牛群或在凈化初期，采用i-ELISA或RBT、MRT方法檢測初篩，結(jié)果陽性的樣品采用c-ELISA或SAT、CFT方法檢測確診。推薦i-ELISA方法初篩、c-ELISA方法確診組合。6.4.2并聯(lián)檢測。對于感染率<2%的奶牛群或在凈化后期，采用i-ELISA、RBT、MRT、c-ELISA等兩種以上方法平行檢測，任一方法檢測結(jié)果陽性或可疑視為感染陽性牛。3DB13/Txxxx—20226.5檢測頻率6.5.1外引牛檢測。引入前在輸出地檢測一次，引入后隔離45d~60d，混群前再檢測一次。6.5.2流產(chǎn)牛檢測。及時(shí)對流產(chǎn)母牛進(jìn)行血清學(xué)檢測，對流產(chǎn)物進(jìn)行病原學(xué)檢測。6.5.3感染牛群檢測。每間隔2個(gè)月~4個(gè)月普檢一次，連續(xù)兩次檢測均為陰性視為假定凈化牛群。6.5.4假定凈化牛群檢測。每間隔4個(gè)月~6個(gè)月普檢一次連續(xù)兩次檢測均為陰性，視為凈化牛群。檢出陽性牛時(shí)按6.5.3執(zhí)行。6.5.5凈化牛群維持檢測。每間隔3個(gè)月~6個(gè)月抽檢一次，根據(jù)凈化狀態(tài)維持情況延長檢測間隔；抽樣方法、抽樣數(shù)量和覆蓋范圍參照6.1執(zhí)行，檢出陽性時(shí)按6.5.3執(zhí)行。6.6患病牛和感染陽性牛處理。發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病患病牛和確診感染陽性牛立即隔離、限制移動(dòng)，按《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》和GB16548的規(guī)定報(bào)告、撲殺和處理。7生物安全7.1場區(qū)建設(shè)場址選擇符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《動(dòng)物防疫條件審查辦法》的距離要求，建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)符合NY/T1567，場區(qū)設(shè)計(jì)及布局設(shè)施符合NY/T682和GB16568的要求。7.2種源管理7.2.1國內(nèi)引進(jìn)種用牛、乳用牛、精液、胚胎，應(yīng)來源于取得《種畜禽生產(chǎn)經(jīng)營許可證》的單位，優(yōu)先選擇“國家級布魯氏菌病凈化場”，具有《動(dòng)物檢疫合格證明》、《系譜證》和有資質(zhì)實(shí)驗(yàn)室部門出具的布魯氏菌病、結(jié)核病檢測結(jié)果陰性報(bào)告和口蹄疫病原學(xué)、血清學(xué)檢測合格報(bào)告。引進(jìn)的種用牛符合《種用動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)》，乳用牛符合《乳用動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)》，凍精符合GB4143的相關(guān)規(guī)定。7.2.2國外引進(jìn)活牛、精液、胚胎應(yīng)具有國務(wù)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村主管部門簽發(fā)的審批意見及出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)出具的《入境貨物檢驗(yàn)檢疫證明》。7.2.3活牛引入后隔離觀察45d~60d，再進(jìn)行一次布魯氏菌病檢測，確認(rèn)陰性方可混群。7.2.4使用精液、胚胎應(yīng)詳細(xì)記錄，必要時(shí)使用前再進(jìn)行一次布魯氏菌病檢測，確認(rèn)陰性后再使用。7.2.5對外銷售乳用牛、胚胎應(yīng)提供有資質(zhì)實(shí)驗(yàn)室出具的布魯氏菌病、結(jié)核病檢測陰性報(bào)告以及口蹄疫病原學(xué)和血清學(xué)檢測合格報(bào)告。7.3生產(chǎn)管理7.3.1飼養(yǎng)管理。飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)符合《奶牛場標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》、NY/T5049、NY/T34的要求。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，禁止飼養(yǎng)其他動(dòng)物。7.3.2牛奶管理。牛奶出場前自檢、盛裝、貯藏和運(yùn)輸符合NY5045要求，奶?；疾『退幬餁埩羝陂g的牛奶不得出售。7.3.3追溯管理。奶牛佩戴耳標(biāo)、建立檔案符合《畜禽標(biāo)識與養(yǎng)殖檔案管理辦法》要求，保證可追溯到奶牛個(gè)體。7.4人員管理7.4.1外來人員無必要禁止進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)。7.4.2本場職工無布魯氏菌病、結(jié)核?。幻磕甓ㄆ谶M(jìn)行健康體檢，上崗職工應(yīng)取得人獸共患病健康合格證明；建立職工健康檔案。7.4.3本場職工無必要不得串區(qū)、串舍，不得對外兼職，不接觸場外牛、羊等易感動(dòng)物，禁止帶入場區(qū)生鮮的牛羊肉、乳等風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品。各功能區(qū)、棟舍的崗位職工相對固定，無必要不串區(qū)、不串舍。7.4.4從事飼養(yǎng)、配種、接產(chǎn)、擠奶、診療、免疫以及保定、佩標(biāo)、采樣、檢測等與奶牛密切接觸的工作，尤其接觸病牛及其污染物、病料等感染材料時(shí)，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)程度選擇性穿戴口罩、手套、工作服、護(hù)目鏡、面罩等防護(hù)用品；不可正對奶牛面部，避免奶牛噴嚏飛沫濺到身上；操作期間禁止飲食、吸煙和接打電話。操作人員裸露部位意外接觸到疫苗或感染材料，用肥皂水清洗，工作結(jié)束可用0.1%新潔爾滅洗手和前臂，4DB13/Txxxx—2022或75%酒精擦拭。7.4.4制定不同崗位人員防護(hù)操作規(guī)程，加強(qiáng)職業(yè)健康教育、生物安全和防護(hù)知識培訓(xùn)，提供必要的防護(hù)用品。7.5運(yùn)輸工具與器具管理7.5.1一切車輛無必要不進(jìn)場，本場職工用車停在場外，生產(chǎn)區(qū)內(nèi)專用運(yùn)輸工具禁止駛出本區(qū)。7.5.2各功能區(qū)和牛舍的器具、用具和運(yùn)輸工具專用，禁止外借和交叉使用。7.6消毒管理7.6.1進(jìn)入場區(qū)消毒。場區(qū)門口設(shè)置覆蓋全車的車輛消毒通道和人員消毒通道，進(jìn)場車輛和人員分別經(jīng)各自通道消毒后方可進(jìn)入。7.6.2進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)消毒。生產(chǎn)區(qū)門口設(shè)置人員消毒通道、車輛消毒通道和物品消毒間，進(jìn)入人員需經(jīng)消毒、洗浴、更衣，進(jìn)入車輛和物品需經(jīng)消毒。7.6.3進(jìn)入牛舍消毒。在舍門口洗手消毒，腳踏消毒池或消毒墊后方可進(jìn)入。7.6.4設(shè)施設(shè)備消毒。牛舍、給水、給料、排污等固定設(shè)施設(shè)備定期清理、清掃、清洗、消毒；擠奶廳以及擠奶、配種、接產(chǎn)、診療等器具使用前后清洗消毒。7.6.5牛體消毒。擠奶、配種、接產(chǎn)、診療、注射、采樣、佩標(biāo)等任何與奶牛接觸操作前，應(yīng)對接觸部位及周圍進(jìn)行擦拭消毒。7.6.6場所環(huán)境消毒。病死牛、流產(chǎn)物、胎衣及時(shí)清除，污染的場所嚴(yán)格消毒。場區(qū)及周圍保持清潔，定期進(jìn)行環(huán)境消毒。7.6.7建立健全消毒制度。建立適合本場的消毒管理制度，配備必要的清洗消毒設(shè)備，制定關(guān)鍵環(huán)節(jié)和風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)消毒操作規(guī)程；選擇殺菌譜廣、消毒力強(qiáng)、對人和牛安全、無殘留毒性、對設(shè)施設(shè)備無腐蝕的消毒劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，定期更換。禁止不同消毒劑混合使用，做好消毒記錄。7.7防疫管理7.7.1衛(wèi)生與獸醫(yī)防疫。符合GB16568、NY5047要求。7.7.2疫苗免疫。強(qiáng)制免疫病種符合國務(wù)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村主管部門的相關(guān)規(guī)定；疫苗選擇符合NY5030相關(guān)規(guī)定；疫苗的運(yùn)輸、貯存、使用符合NY/T1952相關(guān)規(guī)定；建立免疫檔案。實(shí)施布魯氏菌疫苗免疫前，應(yīng)當(dāng)向所在地縣級以上農(nóng)業(yè)農(nóng)村主管部門提出申請，逐級報(bào)至省級農(nóng)業(yè)農(nóng)村主管部門備案。7.7.3生物媒介控制。牛舍、料庫防鳥、滅鼠；昆蟲茲生季節(jié)殺滅蚊蠅。7.7.4無害化處理。病死牛、流產(chǎn)物、胎衣處理符合GB16548；糞污、墊料、醫(yī)療廢棄物等排放和無害化處理符合GB18596和GB7959規(guī)定。7.7.5動(dòng)物疫情處置。按《動(dòng)物防疫法》、《重大動(dòng)物疫情應(yīng)急條例》、單病種的應(yīng)急預(yù)案、實(shí)施方案、防治技術(shù)規(guī)范等國家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5DB13/Txxxx—2022附錄A（規(guī)范性附錄）布魯氏菌抗體瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)光滑型布魯氏菌經(jīng)三氯乙酸提取獲得2種抗原，一種是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS另一種是稱為天然半抗原（NativeHapten，NH）的多聚糖。LPS抗原免疫原性強(qiáng)，自然菌和疫苗菌均可刺激機(jī)體產(chǎn)生LPS抗體。NH抗原免疫原性弱，自然菌感染尤其在活動(dòng)期或排菌期持續(xù)強(qiáng)烈刺激機(jī)體產(chǎn)生NH抗體，而疫苗菌很難產(chǎn)生NH抗體?？乖c血清抗體均可在瓊脂凝膠上擴(kuò)散，結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)在瓊脂界面出現(xiàn)可見沉淀線。LPS抗原分子量大、擴(kuò)散慢，沉淀線則靠近抗原端，NH抗原分子量小、擴(kuò)散快，沉淀線則靠近被檢血清端。據(jù)此可以鑒別自然感染抗體和疫苗免疫抗體。A.2材料A.2.1儀器與耗材恒溫恒濕培養(yǎng)箱，10μL~100μL的移液器及吸頭。A.2.2試劑布魯氏菌病抗體瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試劑盒，包含瓊脂平板、LPS和NH混合抗原、陽性對照血清和陰性對照血清。A.2.3被檢血清牛的新鮮血清。A.3操