生物化學(xué)第三章 酶課件

生物化學(xué)Biochemistry生物化學(xué)第三章酶第三章酶Enzyme

生物化學(xué)第三章酶第一節(jié)概述一、酶促反應(yīng)的特點

酶的催化作用圖解底物酶分解反應(yīng)產(chǎn)物酶促反應(yīng)生物化學(xué)第三章酶酶的催化反應(yīng)的特性（1）催化效率更高（2）專一性高（3）酶的不穩(wěn)定性。

(4)酶在體內(nèi)受到嚴(yán)格調(diào)控。生物化學(xué)第三章酶二、酶的命名與分類(一)酶的命名1、習(xí)慣命名2、國際系統(tǒng)命名生物化學(xué)第三章酶1、氧化還原酶類

2、轉(zhuǎn)移酶類3、水解酶類4、裂合酶類5、異構(gòu)酶6、合成酶(二)酶的分類生物化學(xué)第三章酶第二節(jié)酶的組成與結(jié)構(gòu)一、酶的組成1、單純酶、結(jié)合酶單純由氨基酸組成。如脲酶、胃蛋白酶、淀粉酶、細胞色素C氧化酶等。結(jié)合酶由蛋白質(zhì)部分與非蛋白質(zhì)部分組成生物化學(xué)第三章酶結(jié)合酶類，全酶、復(fù)合酶酶蛋白非蛋白組分金屬離子:Fe,Cu,Zn,Mg

輔酶：NAD,NADP,輔酶A(CoA)輔基：FAD,FMN,血紅素（Fe）全酶=酶蛋白+輔酶（輔基）

生物化學(xué)第三章酶

輔酶

(coenzyme):

與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。輔基

(prostheticgroup):

與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。輔助因子生物化學(xué)第三章酶酶蛋白決定反應(yīng)的特異性

輔助性因子決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)二者結(jié)合成完整的分子全酶才具有催化活性

生物化學(xué)第三章酶（二）單體酶、寡聚酶、多聚復(fù)合體1)單體酶（monomericenzyme）：僅有一個亞基（一或幾條多肽鏈）構(gòu)成，屬于這種類型的酶比較少，一般是催化水解反應(yīng)的酶，這類酶得到了較為廣泛的應(yīng)用。生物化學(xué)第三章酶2)寡聚酶(oligomericenzyme)：由多個相同或不同的亞基組成，亞基之間以非共價鍵結(jié)合，彼此容易分開，單個亞基沒有催化活性。生物化學(xué)第三章酶3)多酶復(fù)合物(multienzymesystem)：幾個酶鑲嵌而成的復(fù)合物。這些酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng)。丙酮酸脫氫酶系（E.coli）：丙酮酸脫氫酶（EⅠ）、硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（EⅡ）和二氫硫辛酰脫氫酶（EⅢ）。EⅠEⅡEⅢ堿性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲生物化學(xué)第三章酶

酶是蛋白質(zhì)，酶同樣有一、二、三、四級結(jié)構(gòu)。酶活性的表現(xiàn)是以特定的空間結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，但空間結(jié)構(gòu)最終是由一級結(jié)構(gòu)來決定的。

二、酶分子的結(jié)構(gòu)生物化學(xué)第三章酶（一）酶的活性部位活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。

酶活性部位的概念生物化學(xué)第三章酶底物在胰凝乳蛋白酶的活性部位與酶結(jié)合生物化學(xué)第三章酶必需基團：與酶活性密切相關(guān)的基團。這些基團若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失。生物化學(xué)第三章酶底物活性中心以外的必需基團結(jié)合基團催化基團活性中心生物化學(xué)第三章酶（二）酶原和酶原的激活

有些酶，在最初合成和分泌時，沒有催化活性。這種酶的前體，被稱為酶原(zymogen)。使無活性的酶原轉(zhuǎn)變成活性酶的過程，稱為酶原激活。其實質(zhì)是酶活性中心的組建。生物化學(xué)第三章酶消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活←胰蛋白酶抑制劑（胰腺）生物化學(xué)第三章酶胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活生物化學(xué)第三章酶賴?yán)i天天天天甘異賴?yán)i天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活生物化學(xué)第三章酶酶原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心

一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解掉一個或幾個短肽在特定條件下

酶原激活的機理

生物化學(xué)第三章酶

酶原激活的生理意義

避免細胞產(chǎn)生的酶對細胞進行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進行。有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。生物化學(xué)第三章酶（三）同工酶（isoenzyme）

同工酶:指能催化相同化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生物學(xué)功能不同的一組酶。

生物化學(xué)第三章酶其特點：（1）它們存在于生物的同一種屬或同一個體的不同組織、甚至同一組織、同一細胞中。（2）同工酶大多數(shù)是由兩個或兩個以上的亞基組成的寡聚體。生物化學(xué)第三章酶

LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5(H4)(H3M)(H2M2)(HM3)(M4)M

H乳酸脫氫酶（LDH）生物化學(xué)第三章酶同工酶研究的意義

（1）進行遺傳分析、雜種優(yōu)勢的篩選。（2）進行疾病診斷（3）不同組織的代謝特點生物化學(xué)第三章酶第三節(jié)影響酶促反應(yīng)速度的因素酶促反應(yīng)動力學(xué)研究酶促反應(yīng)的速度規(guī)律及各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響。生物化學(xué)第三章酶影響因素包括有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。※研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。

※初速度(v)：在酶促反應(yīng)過程中，初始底物濃度消耗在5%以內(nèi)的速度生物化學(xué)第三章酶酶活性

也稱酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活性是研究酶的特性、分離純化以及酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用時的一項不可缺少的指標(biāo)。生物化學(xué)第三章酶

酶活力是用在一定條件下，它所催化某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來表示。酶反應(yīng)速度（指初速度）可用單位時間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示，其單位（表示方法）是：濃度變化/單位時間。生物化學(xué)第三章酶酶活力單位

酶活力單位（enzymeactivityunit），在特定條件（溫度為25℃，其它條件為最適）下，每分鐘內(nèi)催化1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的催化能力（所需的酶量）定為一個酶活力單位（即國際單位IU）。1IU＝1μmol/min。生物化學(xué)第三章酶比活力比活力（SpecificActivity）是指：單位重量的蛋白質(zhì)中所含有的酶活力單位數(shù)，一般用IU/mg蛋白質(zhì)來表示。比活力可以代表酶的純度，酶的比活力越高，說明酶的純度越高。生物化學(xué)第三章酶一、底物濃度對反應(yīng)速度的影響生物化學(xué)第三章酶中間復(fù)合物學(xué)說

E：enzyme；S：substrate；P：product1903年，Henri以蔗糖酶研究底物與反應(yīng)速率關(guān)系，與Wurtz提出酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說E+Sk1k2k3ESE+P生物化學(xué)第三章酶[S]VVmax當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。生物化學(xué)第三章酶[S]VVmax隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。生物化學(xué)第三章酶[S]VVmax當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_一定程度反應(yīng)速度不再增加，達最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)。生物化學(xué)第三章酶

vVmax[S]Km+[S]＝──1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程。生物化學(xué)第三章酶[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度Ｋm：米氏常數(shù)vVmax[S]Km+[S]＝──生物化學(xué)第三章酶米氏常數(shù)的意義

Km值是酶的特征常數(shù)，只與酶性質(zhì)反應(yīng)環(huán)境有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。判斷酶的最適底物，如蔗糖酶：水解蔗糖Km=28；水解綿子糖Km=350可近似地表示酶對底物親和力的大小生物化學(xué)第三章酶過氧化氫酶己糖激酶碳酸酐酶胰凝乳蛋白酶Β-半乳糖苷酶蘇氨酸脫水酶生物化學(xué)第三章酶Km值可用來表示酶對底物的親和力K2+K3＝Km

，當(dāng)K2＞＞K3

時，K1＝[E][S]K2[ES]K1Km＝＝Ks（解離常數(shù)）Km和酶與底物的親和力成反比

E+Sk1k2k3ESE+P生物化學(xué)第三章酶一、底物濃度的影響（15分鐘）二、酶濃度的影響（15分鐘）三、溫度的影響（15分鐘）四、pH的影響（15分鐘）五、激活劑的影響（15分鐘）六、抑制劑的影響（10分鐘）生物化學(xué)第三章酶第四節(jié)酶與醫(yī)學(xué)的關(guān)系及在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用（總85分鐘）一、酶與疾病的發(fā)生（30分鐘）二、酶與疾病的診斷（30分鐘）三、酶與疾病的治療（25分鐘）生物化學(xué)第三章酶酶學(xué)研究簡史公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。一百余年前，Pasteur認(rèn)為發(fā)酵是酵母細胞生命活動的結(jié)果。1877年，Kuhne首次提出Enzyme一詞。1897年，Buchner兄弟用不含細胞的酵母提取液，實現(xiàn)了發(fā)酵。1926年，Sumner首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶。1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，JackW.Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)。生物化學(xué)第三章酶一、酶的概念及特點酶是活細胞產(chǎn)生的一類具有催化功能的生物分子，所以又稱為生物催化劑（Biocatalysts）。絕大多數(shù)的酶都是蛋白質(zhì)。酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)Enzymaticreaction。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為該酶的底物（substrate）。生物化學(xué)第三章酶酶催化作用的特點2、酶催化作用的特性：反應(yīng)所需條件溫和：常溫、常壓、pH=7；高效性：反應(yīng)速度與不加催化劑相比可提高108～1020，與加普通催化劑相比可提高107～1013；專一性：即酶只能對特定的一種或一類底物起作用。易失活：（活性）受調(diào)節(jié)：活性往往與小分子有關(guān)。1、酶和一般催化劑均具有的共性：用量少而催化效率高；能改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但不能改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點。通過降低反應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)的進行。生物化學(xué)第三章酶二、酶的分類與命名（一）酶的命名1、習(xí)慣命名法（1961年以前）根據(jù)其催化底物來命名；根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；結(jié)合上述兩個原則來命名，有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點。例如：淀粉酶、水解酶、琥珀酸脫氫酶2、國際系統(tǒng)命名法國際酶學(xué)會議1961年提出每一種酶有一個系統(tǒng)名稱和習(xí)慣名稱。系統(tǒng)名稱包括底物名稱、反應(yīng)性質(zhì)。例如：酶催化的反應(yīng):谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶系統(tǒng)名稱:丙氨酸：

-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶生物化學(xué)第三章酶（二）酶的國際系統(tǒng)分類及酶的編號將所有的酶促反應(yīng)按反應(yīng)性質(zhì)分為六大類，每一大類又分為若干個亞類和亞亞類，分別用1、2、3、4、5、????編號。所以每一個酶的分類編號由四個數(shù)字組成，數(shù)字間用“?”隔開，編號之前冠以EC（EnzymeCommision)。1.氧化還原酶類(oxidoreductases)2.轉(zhuǎn)移酶類(transferases)3.水解酶類(hydrolases)4.裂解酶類(lyases)5.異構(gòu)酶類(isomerases)6.合成酶類(ligases,synthetases)乳酸脫氫酶

EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號生物化學(xué)第三章酶一些酶的命名舉例生物化學(xué)第三章酶氧化還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。氧化酶：A·2H+O2

=A+H2O22A·2H+O2=2A+2H2O脫氫酶：A·2H+B=A+B·2H如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1、氧化還原酶類Oxido-reductases生物化學(xué)第三章酶2、轉(zhuǎn)移酶類Transferases

催化基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。

A·X+B=A+B·X例如：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（EC2.6.1.2）催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。生物化學(xué)第三章酶3、水解酶類hydrolases水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。

A-B+H2O=AOH+BH水解酶類大都屬于胞外酶,在生物體內(nèi)分布最廣,數(shù)量最多.常見的有淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂肪酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的酯的水解反應(yīng)：生物化學(xué)第三章酶4、裂合酶類Lyases裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。

A·B=A+B主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸（水合）酶催化的反應(yīng)生物化學(xué)第三章酶5、異構(gòu)酶類isomerases異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團或原子的重排過程。

A=B這類酶包括消旋酶、差向異構(gòu)酶、順反異構(gòu)酶、分子內(nèi)氧化還原酶、分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶和分子內(nèi)裂解酶等亞類。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。生物化學(xué)第三章酶6、合成酶類（synthatases或ligases連接酶類）催化有ATP參與的合成反應(yīng)，即由兩種物質(zhì)合成一種新物質(zhì)的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。

A+B+ATP+H2O=A·B+ADP+Pi這類酶包括生成C=O，C-S，C-N，C-C和磷酸酯鍵5個亞類。例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。丙酮酸+CO2+ATP+H2O

草酰乙酸+ADP+Pi+2H+生物化學(xué)第三章酶三、酶的化學(xué)本質(zhì)及其組成（一）酶的化學(xué)本質(zhì)除有催化活性的RNA和DNA外，酶的化學(xué)本質(zhì)幾乎都是蛋白質(zhì)。1、主要依據(jù)酶經(jīng)水解后的最終產(chǎn)物是氨基酸；酶能被蛋白酶水解；使蛋白質(zhì)變性的因素都可以使酶變性失活；具有不能透過半透膜等膠體性質(zhì)具有蛋白質(zhì)所特有的顏色反應(yīng)；JamesBachellerSumner生物化學(xué)第三章酶2、核酶（Ribozyme）具有催化功能的RNA，稱為核酶。20世紀(jì)80年代初期，美國Cech和Altman各自獨立發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能，為此兩人共同獲得1989年度諾貝爾化學(xué)獎。發(fā)現(xiàn)四膜蟲L19RNA在一定條件下能專一地催化寡聚核苷酸底物的切割與連接，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。大多數(shù)核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與RNA自身剪切、加工過程。

生物化學(xué)第三章酶建議的L19RNA催化機理生物化學(xué)第三章酶核酶的種類催化分子內(nèi)反應(yīng)的核酶催化分子間反應(yīng)的核酶自我剪接型核酶自我剪切型核酶錘頭型核酶發(fā)夾型核酶RNaseP丁型肝炎病毒核酶Ⅰ型內(nèi)含子Ⅱ型內(nèi)含子生物化學(xué)第三章酶對酶及生物催化劑的認(rèn)識的發(fā)展

……生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：天然酶（Enzyme）極端酶（extremozyme）抗體酶（abzyme）生物工程酶核酸類：Ribozyme;Deoxyribozyme模擬生物催化劑

克隆酶

遺傳修飾酶

蛋白質(zhì)工程新酶生物化學(xué)第三章酶（二）酶的組成蛋白質(zhì)部分：酶蛋白(apoenzyme)輔助因子(cofactor)

金屬離子小分子有機化合物全酶(holoenzyme)單純酶(simpleenzyme)結(jié)合酶(conjugatedenzyme)生物化學(xué)第三章酶1、輔助因子分類（按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度）

輔酶

(coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。

輔基

(prostheticgroup):與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。生物化學(xué)第三章酶2、各部分在催化反應(yīng)中的作用酶蛋白決定反應(yīng)的特異性輔助因子決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失。

金屬激活酶(metal-activatedenzyme)金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密。生物化學(xué)第三章酶小分子有機化合物在催化中的作用

生物化學(xué)第三章酶（三）酶的分類單體酶(monomericenzyme)：僅具有三級結(jié)構(gòu)的酶。寡聚酶(oligomericenzyme)：由多個相同或不同亞基以非共價鍵連接組成的酶。多酶體系(multienzymesystem)：由幾種不同功能的酶彼此通過非共價鍵聚合形成的多酶復(fù)合物。多功能酶(multifunctionalenzyme)或串聯(lián)酶(tandemenzyme)：一些多酶體系在進化過程中由于基因的融合，多種不同催化功能存在于一條多肽鏈中，這類酶稱為多功能酶。生物化學(xué)第三章酶四、酶的結(jié)構(gòu)與功能（一）活性中心與必需基團必需基團(essentialgroup)：酶分子中氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)基團中，一些與酶活性密切相關(guān)的化學(xué)基團。1、概念酶的活性中心(activecenter)：或稱活性部位(activesite)，是指酶分子中直接和底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。生物化學(xué)第三章酶一般認(rèn)為活性中心有兩個功能部位，一是結(jié)合部位，底物在此部位結(jié)合到酶分子上。所需的必需基團稱為結(jié)合基團(bindinggroup)；

第二個是催化部位，底物的鍵在此被打斷或形成新的鍵。該部位相應(yīng)的必需基團稱為催化基團(catalyticgroup)

2、活性中心的特點在酶分子中只占相當(dāng)小的部分是一個三維實體酶的活性部位通過誘導(dǎo)契合過程和底物互補。位于酶分子表面的一個裂縫內(nèi)底物主要通過次級鍵與酶結(jié)合具有柔性和可運動性生物化學(xué)第三章酶底物活性中心以外的必需基團結(jié)合基團催化基團活性中心生物化學(xué)第三章酶溶菌酶的活性中心*谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基團；*色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是結(jié)合基團；*A~F為底物多糖鏈的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。生物化學(xué)第三章酶溶菌酶催化的反應(yīng)生物化學(xué)第三章酶AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心生物化學(xué)第三章酶胰凝乳蛋白酶的結(jié)構(gòu)生物化學(xué)第三章酶（二）酶原的激活機體內(nèi)的某些酶，特別是一些與消化有關(guān)的酶，在最初合成與分泌時，沒有催化活性，這種沒有催化活性的酶的前體稱為酶原（zymogen或proenzyme）。酶原在一定條件下經(jīng)過蛋白水解酶等專一作用后，構(gòu)象發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變形成有活性酶的過程，稱為酶原的激活。酶原激活過程的實質(zhì)是酶的活性中心形成或暴露的過程。例如：胰蛋白酶原的激活酶原激活的生理意義：避免細胞產(chǎn)生的酶對細胞進行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進行。有的酶原可以視為酶的儲存形式。生物化學(xué)第三章酶賴?yán)i天天天天甘異賴?yán)i天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活過程生物化學(xué)第三章酶（三）同工酶（isozyme或isoenzyme）

同工酶是指催化相同的反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。同工酶不僅存在于同一個體的不同組織中，甚至同一組織、同一細胞的不同亞細胞結(jié)構(gòu)中。舉例：乳酸脫氫酶(LDH1～LDH5)所有的LDH都是由4個亞基聚合，含兩種不同亞基，即肌肉型（M）和心肌型（H）。有5種同工酶。此外在動物睪丸及精子中還發(fā)現(xiàn)了另一種基因編碼的x亞基組成了LDHx。生物化學(xué)第三章酶催化反應(yīng)：

乳酸COOHCH(OH)CH3COOHCOCH3NAD+NADH+H+++丙酮酸LDHHHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)乳酸脫氫酶的同工酶生物化學(xué)第三章酶同工酶研究的意義在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用；用于解釋發(fā)育過程中階段特有的代謝特征；同工酶譜的改變有助于對疾病的診斷；同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345生物化學(xué)第三章酶五、酶催化的專一性（一）結(jié)構(gòu)專一性（二）立體異構(gòu)專一性相對專一性絕對專一性旋光異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性鍵專一性基團專一性（族專一性）生物化學(xué)第三章酶有些酶對底物的要求不是很嚴(yán)格，可作用于一類結(jié)構(gòu)相似的底物，這種專一性稱為“相對專一性”。有些酶只要求作用于底物一定的鍵，而對鍵兩端的基團無要求，這種相對專一性稱為“鍵專一性”。如酯酶有些酶作用于底物時，對鍵兩端的基團要求不同，對其中一個基團要求嚴(yán)格，對另一個要求不嚴(yán)格，這種專一性稱為“族專一性”或“基團專一性”。如α-D-葡萄糖苷酶有些酶對底物的要求非常嚴(yán)格，只作用于一種底物，這種專一性稱為“絕對專一性”。如脲酶當(dāng)?shù)孜锞哂辛Ⅲw異構(gòu)體時，酶只能作用于其中的一種，這種專一性稱為“立體異構(gòu)專一性”。當(dāng)?shù)孜锞哂行猱悩?gòu)體時，酶只能作用于其中一種。當(dāng)?shù)孜锞哂袔缀萎悩?gòu)體時，酶只能作用于其中一種。生物化學(xué)第三章酶RCOO-+ROH+H+′酯酶：R—C—O—R′+H2OOOCH2OHOHOHOH15α-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH脲酶：H2N—C—NH2+H2OO2NH3+CO2生物化學(xué)第三章酶（三）關(guān)于酶作用專一性的假說1、底物和酶相互作用的“三點附著”學(xué)說認(rèn)為酶與底物的結(jié)合處至少有三個點，而且只有一種情況是完全互補的形式。只有這種情況下，不對稱催化作用才能實現(xiàn)。生物化學(xué)第三章酶

該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，只是酶與底物相互接近時，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進而相互結(jié)合。這一過程稱為酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說2、鎖鑰假說(lockandkeyhypothesis)：

認(rèn)為整個酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對一把鎖一樣3、誘導(dǎo)契合假說（induced–fithypothesis):

生物化學(xué)第三章酶誘導(dǎo)契合學(xué)說生物化學(xué)第三章酶六、酶的作用機制（一）酶能降低化學(xué)反應(yīng)的活化能活化能：分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。是指在一定溫度下，1mol反應(yīng)物全部進入活化狀態(tài)所需的自由能。過渡態(tài)分子：是反應(yīng)物處于被激活的狀態(tài)，是反應(yīng)途徑中具有最高能量的形式，是分子的不穩(wěn)定態(tài)。生物化學(xué)第三章酶酶和一般催化劑的作用一樣，就是降低化學(xué)反應(yīng)所需的活化能，從而使活化分子數(shù)增多，反應(yīng)速度加快。酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個低活化能的途徑進行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。例如：過氧化氫分解為水和氧的反應(yīng)，其分子活化能為每摩爾75348焦耳，用鉑做催化劑，則所需活化能為48976焦耳，用過氧化氫酶催化時，活化能降至8372焦耳。生物化學(xué)第三章酶（二）中間產(chǎn)物學(xué)說酶在催化反應(yīng)時，首先與底物結(jié)合成一個不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物ES，然后ES再分解成產(chǎn)物和原來的酶。中間產(chǎn)物很不穩(wěn)定，容易分解。但有證據(jù)表明中間產(chǎn)物的存在。中間產(chǎn)物存在的證據(jù)：1.同位素32P標(biāo)記底物法（磷酸化酶與葡萄糖結(jié)合）；2.吸收光譜法（過氧化物酶與過氧化氫結(jié)合）。生物化學(xué)第三章酶（三）誘導(dǎo)契合學(xué)說鎖鑰學(xué)說（Fischer，1890）：酶的活性中心結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)互相吻合，緊密結(jié)合成中間絡(luò)合物。誘導(dǎo)契合學(xué)說（Koshland，1958）：酶活性中心的結(jié)構(gòu)有一定的靈活性，當(dāng)?shù)孜铮せ顒┗蛞种苿┡c酶分子結(jié)合時，酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生了有利于與底物結(jié)合的變化，使反應(yīng)所需的催化基團和結(jié)合基團正確地排列和定向，轉(zhuǎn)入有效的作用位置，這樣才能使酶與底物完全吻合，結(jié)合成中間產(chǎn)物。生物化學(xué)第三章酶羧肽酶的誘導(dǎo)契合模式底物生物化學(xué)第三章酶（四）酶和過渡態(tài)底物分子互補——過渡態(tài)理論1946年，LinusPauling提出過渡態(tài)理論。酶與底物的過渡態(tài)互補，親合力最強，釋放出結(jié)合能使ES的過渡態(tài)能級降低，有利于底物分子跨越能壘，加速酶促反應(yīng)速度。研究證實過渡態(tài)類似物與酶結(jié)合比底物緊密102~106，證明該理論的正確性。生物化學(xué)第三章酶（五）抗體酶1986年Schultz與Lermer兩個實驗室同時成功得到具有酶催化活性的抗體。 催化性抗體通常不及酶的催化效率高。抗體酶的研究為酶的過渡態(tài)理論提供了有力的實驗依據(jù)。即是抗體又具有催化功能的蛋白質(zhì)稱為“抗體酶”，又稱為催化性抗體（catalyticantibody）。如果設(shè)計一種S→P的過渡態(tài)類似物，用它作為半抗原免疫動物將有可能產(chǎn)生能催化S→P反應(yīng)的抗體。生物化學(xué)第三章酶假想的一種催化金屬棒斷裂的酶用來降低反應(yīng)活化能的大量能量來自于酶和底物之間弱的非共價的相互作用。ES復(fù)合物中每一次弱的相互作用的形成伴隨著少量能量的釋放。稱之為“結(jié)合能”。因此，結(jié)合能是酶用來降低反應(yīng)活化能的主要自由能來源。生物化學(xué)第三章酶（六）使酶具有高催化效率的因素

1、鄰近與定向效應(yīng)

2、“張力”與“形變”酶與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物過程中，底物分子從稀溶液中密集到活性中心區(qū)，并使活性中心的催化基團與底物的反應(yīng)基團之間正確定向排列所產(chǎn)生的效應(yīng)酶與底物的結(jié)合，不僅酶分子發(fā)生構(gòu)象變化，同樣底物分子也會發(fā)生扭曲變形，使底物分子的某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，降低了反應(yīng)活化能。生物化學(xué)第三章酶

3、酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過酸提供質(zhì)子,或是通過堿接受質(zhì)子的作用，達到降低反應(yīng)活化能的過程。酶活性部位上的某些基團可以作為良好的質(zhì)子供體或受體對底物進行酸堿催化。蛋白質(zhì)中起酸或堿催化的功能基團有氨基、羧基、咪唑基、巰基和酚基。His的咪唑基是最有效的酸堿催化基團。生物化學(xué)第三章酶4、共價催化又稱親核催化或親電子催化，催化時，親核催化劑或親電子催化劑分別放出電子或汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負(fù)電中心，迅速形成不穩(wěn)定的共價中間復(fù)合物，降低反應(yīng)活化能，使反應(yīng)加速。酶蛋白上最常見的3種親核基團是：絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。生物化學(xué)第三章酶胰凝乳蛋白酶水解肽鍵的步驟生物化學(xué)第三章酶5、微環(huán)境影響

酶的活性部位位于疏水環(huán)境的裂縫內(nèi)，，當(dāng)?shù)孜锓肿优c活性部位結(jié)合時，被包埋在疏水環(huán)境中。疏水環(huán)境中，底物分子與催化基團之間的作用力比在極性環(huán)境中要強的多，十分有利于酶的催化作用。6、多元催化和協(xié)同效應(yīng)7、金屬離子催化生物化學(xué)第三章酶七、酶促反應(yīng)動力學(xué)

KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

即研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響，并加以定量的闡述。影響因素主要包括：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。酶促反應(yīng)速度必須是反應(yīng)的初速度；研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。生物化學(xué)第三章酶（一）酶促反應(yīng)速度的測量用一定時間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物生成的量來表示酶促反應(yīng)速度。在酶促反應(yīng)過程中，反應(yīng)隨著時間的延長，反應(yīng)速度發(fā)生改變。在反應(yīng)初期，反應(yīng)速度維持恒定，稱為“反應(yīng)初速度”酶反應(yīng)進程曲線

102030405060min產(chǎn)物生成量

要測量一個酶促反應(yīng)的初速度，首先要先繪制反應(yīng)進程曲線。生物化學(xué)第三章酶（二）、酶濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：V=K3[E]0V[E]當(dāng)[S]>>[E]時，Vmax=k3[E]酶濃度對反應(yīng)速度的影響

生物化學(xué)第三章酶（三）底物濃度對反應(yīng)速度的影響1、影響曲線在其他因素不變的情況下，底物濃度對反應(yīng)速度的影響呈矩形雙曲線。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。隨著底物濃度的增高，反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_一定程度，反應(yīng)速度不再增加，達最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)。該影響曲線可以用中間產(chǎn)物學(xué)說來解釋。生物化學(xué)第三章酶2、米氏方程1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelisequation)。ＶVmax[S]Km+[S]＝──[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

生物化學(xué)第三章酶①米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：則：由于酶促反應(yīng)速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時：當(dāng)[Et]=[ES]時，(4)所以

(1)經(jīng)整理得：米－曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個假設(shè)：E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速度取決于慢反應(yīng)即

V＝k3[ES]。(1)S的總濃度遠遠大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變即[S]＝[St]。生物化學(xué)第三章酶②米氏常數(shù)的意義

Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/LVmaxV[S]KmVmax/22＝Km+[S]VmaxVmax[S]Km＝[S]當(dāng)v=Vmax/2時生物化學(xué)第三章酶是酶在一定條件下的特征物理常數(shù)，通過測定Km的數(shù)值，可鑒別酶。從Km可判斷酶的專一性和天然底物。Km最小的底物，通常就是該酶的最適底物，也就是天然底物?？山票硎久负偷孜镉H合力，Km愈小，E對S的親合力愈大，Km愈大，E對S的親合力愈小。在已知Km的情況下，應(yīng)用米氏方程可計算任意[s]時的v，或任何v下的[s]。（用Km的倍數(shù)表示）

Km還可以幫助推斷某一代謝反應(yīng)的方向和途徑。生物化學(xué)第三章酶生物化學(xué)第三章酶③利用作圖法測定Km和Vmax

——雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法Vmax[S]Km+[S]V=兩邊同取倒數(shù)1Km11—=——.—+——V

Vmax

[S]Vmax

斜率生物化學(xué)第三章酶

Hames-Woolf作圖法斜率Eadic-Hofstee作圖法

斜率生物化學(xué)第三章酶練習(xí)題：已知某酶的Km值為0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度的80％時底物的濃度應(yīng)為多少？

過氧化氫酶的Km值為2.5×10-2mol.L-1，當(dāng)其底物過氧化氫濃度為100mmol.L-1時，求該濃度下，酶被底物飽和的程度？生物化學(xué)第三章酶3、米氏方程的局限性其動力學(xué)只適合于單底物反應(yīng)過程，對多底物多產(chǎn)物反應(yīng)不適用。對多酶體系催化的過程不能作很好的解釋。不適合于變構(gòu)酶催化的反應(yīng)。不能直接用來求Vmax生物化學(xué)第三章酶4、雙底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)（機制分類）（1）序列反應(yīng)（sequentialreactions）或單-置換反應(yīng)（single-displacementreactions）底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放有一定的順序，產(chǎn)物不能在底物完全結(jié)合前釋放。即有三元復(fù)合物的產(chǎn)生。又可分為兩種類型：有序反應(yīng)、隨機反應(yīng)（2）乒乓反應(yīng)（PingPongreactions）或雙-置換反應(yīng)（double-displacementreactions）酶與A的反應(yīng)產(chǎn)物（P）是在同第二個底物B結(jié)合前釋放，沒有三元復(fù)合物的產(chǎn)生。（例:A+BP+Q）

生物化學(xué)第三章酶有序反應(yīng)（orderedreactions）

——OrderedBiBi反應(yīng)在A和B與酶之間形成三元復(fù)合物，隨后有序地釋放產(chǎn)物P和Q。例：需要NAD+或NADP+的脫氫酶就屬于這種類型。如乙醇脫氫酶。E+AEAEABEPQEQE+BPQE+NAD+NAD+:ENAD+:E:CH3CH2OHCH3CH2OHNADH:E:CH3CHONADH:E

ENADHCH3CHO生物化學(xué)第三章酶隨機反應(yīng)(randomreactions)

——RandomBiBi反應(yīng)底物隨機與酶結(jié)合，形成三元復(fù)合物；產(chǎn)物隨機釋放。如：肌酸激酶使肌酸磷酸化的反應(yīng)。EABEPQBPE+AEAE+BEBEQE+EPE+QAQP生物化學(xué)第三章酶乒乓反應(yīng)（PingPongreactions

）

——PingPongBiBi反應(yīng)歷程中形成4種二元復(fù)合物，但無三元復(fù)合物形成。氨基轉(zhuǎn)移酶是遵循乒乓反應(yīng)機制的酶E+AEAEPEEBEQE+BPQ生物化學(xué)第三章酶雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低。（四）、溫度對反應(yīng)速度的影響最適溫度(optimumtemperature)：酶促反應(yīng)速度最快時的環(huán)境溫度。*低溫的應(yīng)用酶活性0.51.02.01.50102030405060溫度oC溫度對淀粉酶活性的影響

生物化學(xué)第三章酶（五）、pH對反應(yīng)速度的影響最適pH(optimumpH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。0酶活性pH

pH對某些酶活性的影響

胃蛋白酶淀粉酶膽堿酯酶246810pH影響酶活力的原因：環(huán)境過酸、過堿使酶變性失活；影響酶活性基團的解離；影響底物的解離。生物化學(xué)第三章酶（六）激活劑對反應(yīng)速度的影響凡是能提高酶活性的物質(zhì)，稱為酶的激活劑（activator）類別金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+

陰離子：

Cl-、Br-

有機分子還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金屬螯合劑：EDTA生物化學(xué)第三章酶（七）、抑制劑對反應(yīng)速度的影響1、定義

凡能使酶的催化活性下降或完全喪失而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑(inhibitor)

。2、抑制作用的類型不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition)：競爭性抑制(competitiveinhibition)非競爭性抑制(non-competitiveinhibition)反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)生物化學(xué)第三章酶

不可逆性抑制作用（1）定義抑制劑通常以共價鍵與酶的必需基團相結(jié)合，使酶失活，不能用透析、超濾等物理方法除去使酶復(fù)活。稱為不可逆抑制。

（2）舉例有機磷化合物：與酶分子活性部位的絲氨酸羥基共價結(jié)合。常見有：DFP、敵敵畏、敵百蟲、對硫磷等。有機汞、有機砷化合物：與酶分子中半胱氨酸的巰基作用，抑制含巰基的酶。如對氯汞苯甲酸、路易斯毒氣等。生物化學(xué)第三章酶有機磷化合物路易士氣失活的酶羥基酶失活的酶酸巰基酶失活的酶酸BAL巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物生物化學(xué)第三章酶（3）可逆抑制劑和不可逆抑制劑的判斷

V[E]123同時加底物、抑制劑和酶V[E]231抑制劑與酶先保溫后再加底物生物化學(xué)第三章酶

可逆性抑制作用*概念抑制劑通常以非共價鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制*類型生物化學(xué)第三章酶（１）競爭性抑制作用+IEIE+SE+PES反應(yīng)模式定義抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。

+++EESIESEIEP生物化學(xué)第三章酶抑制曲線動力學(xué)特點：Vmax不變，表觀Km增大。

抑制劑↑

無抑制劑1/V

1/[S]

生物化學(xué)第三章酶舉例

丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸生物化學(xué)第三章酶磺胺類藥物的抑菌機制與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶＋對氨基苯甲酸＋谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸生物化學(xué)第三章酶（2）.非競爭性抑制反應(yīng)模式+S－S+S－S+ESIEIEESEPE+SESE+P+IEI+SEIS

+I定義

抑制劑結(jié)構(gòu)與底物無共同之處，與酶活性部位以外的必需基團結(jié)合，因此酶與抑制劑（底物）結(jié)合后，還可以與底物（抑制劑）結(jié)合。但形成的三元復(fù)合物不能進一步分解為產(chǎn)物，因此酶活力降低。這種抑制稱為非競爭性抑制。生物化學(xué)第三章酶影響曲線動力學(xué)特點：Vmax降低，表觀Km不變。抑制劑↑

1/V

1/[S]無抑制劑例如：亮氨酸是精氨酸酶的一種非競爭性抑制劑；某些金屬離子對酶的抑制作用生物化學(xué)第三章酶（３）.反競爭性抑制E+SE+P

ES+IESI++ESESESIEP定義酶只有與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，但形成的三元復(fù)合物不能進一步分解為產(chǎn)物，因此酶活力降低。這種抑制稱為非競爭性抑制。常見于多底物反應(yīng)中，而在單底物反應(yīng)中少見。反應(yīng)模式生物化學(xué)第三章酶影響曲線動力學(xué)特點：Vmax降低，表觀Km降低。抑制劑↑

1/V

1/[S]無抑制劑

?生物化學(xué)第三章酶各種可逆性抑制作用的比較

生物化學(xué)第三章酶（七）、酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)和別構(gòu)酶1、概念：酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結(jié)合后導(dǎo)致酶分子發(fā)生構(gòu)象改變，進而改變酶的活性，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)(allostericregulation)。具有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用的酶稱別構(gòu)酶(allostericenzyme)。凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為效應(yīng)物(effector)，通常為小分子代謝物或輔因子，甚至是該酶的正常底物。如因別構(gòu)導(dǎo)致酶活性增加的物質(zhì)稱為正效應(yīng)物(positiveeffector)或別構(gòu)激活劑，反之稱負(fù)效應(yīng)物(negativeeffector)或別構(gòu)抑制劑。生物化學(xué)第三章酶酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)示意圖效應(yīng)劑別構(gòu)中心活性中心別構(gòu)酶的反饋調(diào)控機理A

（產(chǎn)物或中間產(chǎn)物）EDCB關(guān)鍵酶

—生物化學(xué)第三章酶2、別構(gòu)酶的特點一般是寡聚酶，由多亞基組成，包括催化部位和調(diào)節(jié)（別構(gòu)）部位；具有別構(gòu)效應(yīng)。指酶和效應(yīng)物（底物，調(diào)節(jié)物）結(jié)合后可以影響酶和底物的結(jié)合能力。動力學(xué)特點：不符合米曼方程雙曲線。常呈“S”形曲線。3、別構(gòu)酶的動力學(xué)分析Koshland等建議用協(xié)同指數(shù)（cooperativityindex，CI）定量判斷與區(qū)分三類酶。協(xié)同指數(shù)又稱飽和比值（saturationratio，Rs）Rs

=酶與底物結(jié)合達90%飽和度時的底物濃度

酶與底物結(jié)合達10%飽和度時的底物濃度Rs=81典型的米氏酶Rs﹤81具有正協(xié)同效應(yīng)的酶Rs﹥81具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶=811/nn代表協(xié)同系數(shù)（Hill系數(shù)）生物化學(xué)第三章酶A--非調(diào)節(jié)酶B--正協(xié)同效應(yīng)C—負(fù)協(xié)同效應(yīng)

別構(gòu)酶與米氏酶的動力學(xué)曲線比較

C﹥81[S]90%V[S]10%V生物化學(xué)第三章酶4、別構(gòu)酶調(diào)節(jié)酶活性的機理①、協(xié)同模型或?qū)ΨQ模型（concertedorsymmetrymodel也稱WMC模型）又稱齊變模型。1965年由Monod、Wyman和Changeux提出模型要點：別構(gòu)酶是由確定數(shù)目、占有相同地位的亞基組成；每一亞基對一種配體（或調(diào)節(jié)物）只有一個結(jié)合位點；每種亞基有兩種構(gòu)象狀態(tài)，一種是有利于結(jié)合底物或調(diào)節(jié)物的松弛型構(gòu)象（relaxedstateR型），另一種為不利于底物或調(diào)節(jié)物結(jié)合的緊張型構(gòu)象（tensedstateT態(tài)）；兩種構(gòu)象的互變采取同步協(xié)同方式。即各亞基在同一時間內(nèi)處于相同的構(gòu)象狀態(tài)。如果一個亞基從T態(tài)變?yōu)镽態(tài)，則其他亞基也幾乎同時轉(zhuǎn)變?yōu)镽態(tài)，不存在TR雜合態(tài)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)由一種構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N構(gòu)象時，分子對稱性保持不變。生物化學(xué)第三章酶②序變模型（sequentialmodel，KNF模型）Koshland、Nemethyl和Filmer于1966年提出。模型要點：當(dāng)配體不存在時，別構(gòu)酶以T態(tài)存在，只有當(dāng)配體與之結(jié)合后才誘導(dǎo)T態(tài)向R態(tài)轉(zhuǎn)變；別構(gòu)酶各亞基的構(gòu)象是以序變方式進行的，而不是齊變。導(dǎo)致有各種TR型雜合態(tài)；亞基間的相互作用可能是正協(xié)同效應(yīng)，也可能是負(fù)協(xié)同效應(yīng)。生物化學(xué)第三章酶SSSSSSSSSSSSSS亞基全部處于R型亞基全部處于T型依次序變化SSSSSSSSSSR狀態(tài)（對稱亞基）SSSST狀態(tài)（對稱亞基）齊變模型序變模型生物化學(xué)第三章酶5、實例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（anspartatetranscarbamoylase，ATCase）（1）催化的反應(yīng)（2）酶的組成大腸桿菌中分離出來的ATCase由12條多肽鏈組成。其中6條形成2個三聚體稱催化亞基，6條形成3個二聚體稱調(diào)節(jié)亞基。每個催化亞基上有3個結(jié)合天冬氨酸的底物結(jié)合部位，每個調(diào)節(jié)亞基上有兩個別構(gòu)效應(yīng)劑（ATP、CTP）的結(jié)合部位。生物化學(xué)第三章酶(3)、ATCase變構(gòu)效應(yīng)的動力學(xué)特征天冬氨酸即是ATCase的底物，又是該酶的正效應(yīng)物。這種底物本身對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用稱為同促效應(yīng)（homotiopiceffect）CTP在不影響酶的Vmax的情況下，通過降低酶與底物之間的親和力抑制ATCase。ATP相反，可增加酶與底物的親和性，也不影響Vmax，是ATCase的激活劑。ATP和CTP相互競爭調(diào)節(jié)部位，高水平的ATP可以阻止CTP對酶的抑制作用。這種非底物分子的調(diào)節(jié)物對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用，稱為異促效應(yīng)（heterotiopiceffect）。生物化學(xué)第三章酶ATCase催化鏈的別構(gòu)轉(zhuǎn)換

無催化活性構(gòu)象(T-型)CCCCCC

RRRRRR有催化活性構(gòu)象(R-型)CCCCCCRRRRRRATP（正效應(yīng)劑）CTP（負(fù)效應(yīng)劑）生物化學(xué)第三章酶八、酶的活力測定和分離純化1、酶活力（enzymeactivity）又稱酶活性，是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可以用在一定條件下所催化反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示。酶促反應(yīng)速度可在適宜的反應(yīng)條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗或產(chǎn)物的生成量來表示。（一）酶活力的測定生物化學(xué)第三章酶國際單位(katal，Kat)

1972年１kat單位是指在最適條件下，每秒鐘使１mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。

國際單位(IU)

1961年在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為一個國際單位。kat與IU的換算：1IU=16.67×10-9kat2、酶的活力單位（activityunit，U）是衡量酶活力大小的尺度，酶單位的定義是：在一定條件下，一定時間內(nèi)將一定的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。這樣酶的含量可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示（U/g或U/ml）生物化學(xué)第三章酶3、酶的比活力（specificactivity）酶的比活力代表酶的純度。國際酶學(xué)委員會規(guī)定比活力用每mg蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活力單位數(shù)表示。對同一種酶來說，比活力越大，表示酶的純度越高。表示酶的催化效率，是指在一定條件下，當(dāng)酶被底物充分飽和時，單位時間內(nèi)（每秒鐘）每個酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。大多數(shù)酶對它們天然底物的轉(zhuǎn)換數(shù)的變化范圍為每秒1到104如果酶的總濃度已知，可從Vmax計算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnovernumber)，即動力學(xué)常數(shù)K3。4、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（turnovernumber

，TN，等于催化常數(shù)kcat）生物化學(xué)第三章酶生物化學(xué)第三章酶練習(xí)題1、有50μg的純酶制劑,5分鐘內(nèi)催化生成了4μmol的產(chǎn)物。該酶分子的平均相對分子質(zhì)量為92000。求酶的比活力、轉(zhuǎn)換數(shù)。2、250mg蛋白酶制品溶于25ml緩沖液中，取0.1ml酶液以酪蛋白為底物測酶活力，測得每小時產(chǎn)生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液測得蛋白氮含量為0.2mg。若以每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為1個活力單位計算，求①1ml酶液中蛋白質(zhì)的含量及酶的活力單位數(shù)；②酶的比活力；③總活力生物化學(xué)第三章酶（二）酶的分離純化1、基本操作程序：選材：微生物（微生物發(fā)酵物:胞內(nèi)酶，胞外酶），動物（動物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞內(nèi)酶先要進行細胞破碎（機械研磨，超聲波破碎，反復(fù)凍融或自溶等），分離：先進行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機溶劑沉淀法，超離心等）。純化：可采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。結(jié)晶：保存：低溫保存。2、注意事項：提取過程中避免酶變性而失去活性；防止強酸、強堿、高溫和劇烈攪拌等；要求在低溫下操作，加入的化學(xué)試劑不使酶變性，操作中加入緩沖溶液等.生物化學(xué)第三章酶3、提純方法優(yōu)劣的判斷一般用兩個指標(biāo)來衡量：總活力的回收；比活力提高的倍數(shù)。在酶的制備過程中，每一步驟都應(yīng)測定留用以及準(zhǔn)備丟棄部分中所含酶的總活力和比活力，以了解經(jīng)某一步驟后酶的回收率，純化倍數(shù)，從而決定該步驟的取舍?？偦盍?活力單位數(shù)/ml酶液×總體積比活力=活力單位數(shù)/mg蛋白氮=總活力單位數(shù)/總蛋白氮mg純化倍數(shù)=每次比活力第一次比活力回收率=每次總活力第一次總活力×100%生物化學(xué)第三章酶生物化學(xué)操作程序-你的第一次蛋白質(zhì)純化作為一個生物化學(xué)研究室里最新最沒有經(jīng)驗的學(xué)生，你的前幾個星期可能用于刷洗玻璃器皿和給試管貼標(biāo)簽。然后逐步學(xué)習(xí)配制各種實驗操作程序所需的緩沖溶液和貯備液。最后，給了你一個制備蛋白質(zhì)的任務(wù)。這是一個參與三羧酸循環(huán)的酶-檸檬酸合酶，位于線粒體基質(zhì)。你從附近的屠宰場取回了20kg的牛心。運輸中將其放在冰上，各步純化也在冰室或冰上進行。用高速攪拌機將牛心組織在含0.2mol/L蔗糖、pH7.2的緩沖溶液中破碎成勻漿。你將濃稠不透明的組織勻漿進行一系列不同的離心。你對含有大多數(shù)完整線粒體的上清繼續(xù)進行純化。接著，你溶漲線粒體，獲得仍不透明但比勻漿液稀得多的裂解液，主要由線粒體膜和內(nèi)含物組成。向裂解液中加入高濃度的硫酸銨鹽到一定比例。離心后棄沉淀留上清液。往上清液中加入一定量硫酸銨，再次離心，保留沉淀。生物化學(xué)第三章酶你將含有線粒體蛋白質(zhì)的沉淀溶解并對大量緩沖液（pH7.2）透析過夜。你將透析液上大小合適的排阻層析柱。按照方案，收集第一個蛋白質(zhì)組分，棄去后面成分。紫外光（280nm）吸收法檢測蛋白質(zhì)。你將收集到的成分上陽離子交換柱層析。棄去開始的穿過液后，加入pH較高的洗脫液，立即收集洗脫下的成分。此時獲得的蛋白質(zhì)溶液略帶粉色。取少量樣品做等電聚焦凝膠電泳，染色后出現(xiàn)3條帶。根據(jù)純化方案目的蛋白的pI為5.6你想對純度做進一步分析，因此切下pI為5.6的帶做SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳。結(jié)果為一條帶。生物化學(xué)第三章酶九、酶工程簡介（一）、化學(xué)酶工程

天然酶

固定化酶

化學(xué)修飾酶

人工模擬酶（二）、生物酶工程

克隆酶

突變酶

新酶

將酶學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合，產(chǎn)生了酶工程(enzymeengineering)這樣一個新的領(lǐng)域。酶工程主要研究酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造以及在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和理論研究等方面的應(yīng)用。生物化學(xué)第三章酶固定化酶

將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理，固定于高分子支持物(或載體)上而成為不溶于水，但仍有酶活性的一種酶制劑形式，稱固定化酶(immobilizedenzyme)。包埋法吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法生物化學(xué)第三章酶酶的改造和模擬

酶的改造：功能基團的化學(xué)修飾酶酶蛋白側(cè)鏈的化學(xué)修飾酶分子內(nèi)或間的交聯(lián)反應(yīng)酶的模擬：根據(jù)酶作用的原理摸擬酶的活性中心和催化機理，用化學(xué)方法制備結(jié)構(gòu)較簡單,高效、高選擇性、穩(wěn)定性能好的新型催化劑,可以是無機化合物、有機化合物或小肽。生物化學(xué)第三章酶人工模擬酶

-benzyme

環(huán)糊精催化側(cè)鏈催化側(cè)鏈連接到環(huán)糊精上，可模擬胰凝乳蛋白酶環(huán)糊精分子結(jié)構(gòu)環(huán)糊精結(jié)構(gòu)模型生物化學(xué)第三章酶生物酶工程示意圖

酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能新酶分子藍圖選擇性修飾方案突變酶

新酶克隆酶產(chǎn)品效用發(fā)展酶基因遺傳設(shè)計遺傳修飾DNA重組技術(shù)DNA重組技術(shù)生物化學(xué)第三章酶考研真題1、（2002中科院）在酶的可逆抑制劑中，不影響酶的二級速率常數(shù)Kcat/Km的是

A.競爭性抑制劑B.非競爭性抑制劑C.反競爭性抑制劑D.都不是2、（2002中科院）所謂多酶體系是指一個代謝過程中的幾個酶形成一個反應(yīng)體系鏈，其通常具有以下性質(zhì)。

A.只在功能上有聯(lián)系B.不僅在功能上，在結(jié)構(gòu)上也有聯(lián)系，形成復(fù)合體

C.上述兩種情況都存在3、（2007中科院）酶的失活意味著酶蛋白已經(jīng)變性。4、（同上）酶的輔因子包括輔酶與輔基，兩者的區(qū)別是前者與酶共價結(jié)合，而后者為非共價鍵結(jié)合。5、（2007中科院）酶分子中Cys殘基的-SH即可以作為親核基團起親核催化，也可以作為廣義酸堿起催化作用。6、（同上）從一個酶對其底物的Km值可以大致判斷出這個酶的催化效率。7、（同上）有ATP參與的催化反應(yīng)的酶有轉(zhuǎn)移酶，也有連接酶。請各舉一例說明兩種酶應(yīng)用ATP的不同特點。（5分）8、（2001上海中科院）酶的純化一般要求在低溫下操作，如果純化一個熱穩(wěn)定的酶是否需要在低溫下操作，請簡述你的見解。生物化學(xué)第三章酶9、（2001南