胸腔積液在肺腺癌基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究

2022胸腔積液在肺腺癌基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究前言肺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型包括腺癌、鱗癌和小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌所占的比例最高，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。在肺癌的診斷及治療過(guò)程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)患者基因突變情況對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者的靶向治療具有重要意義。但臨床上晚期NSCLC患者不能通過(guò)手術(shù)獲取腫瘤組織，部分患者行活檢獲取腫瘤組織樣本比較困難，而且無(wú)論是通過(guò)支氣管鏡對(duì)肺部病灶進(jìn)行穿刺，還是在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮行肺部病灶穿刺，均具有侵入性。氣管鏡穿刺，除涉及到麻醉用藥外，放置氣管鏡的過(guò)程中患者可能有氣管收窄、含氧量下降的情況。超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺有可能導(dǎo)致出血和氣胸。反復(fù)進(jìn)行入侵性有創(chuàng)的方式采集患者組織樣本，實(shí)難可取。因此，探索能夠安全、無(wú)創(chuàng)和可重復(fù)獲取的檢測(cè)樣本具有重要的臨床意義，血液、胸腔積液等液體活檢則具有這些優(yōu)勢(shì)［2,3,并且其樣本基因突變的檢測(cè)也顯示出良好的靈敏度和特異度［4,5。在本研究中，我們比較了胸腔積液與組織、血漿樣本的基因檢出情況，對(duì)胸腔積液作為NSCLC基因檢測(cè)的可替代性樣本進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。資料與方法一、病例選擇和樣本獲取本研究為回顧性研究，納入了2015年2月至2019年12月經(jīng)病理確診為肺腺癌的患者145例，其中來(lái)自北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院129例，北京市房山區(qū)第一醫(yī)院16例；男72例，女73例；年齡30~94歲，中位年齡60歲。吸煙者36例，不吸煙者58例，吸煙史不詳者51例。從標(biāo)本庫(kù)中共獲取145例患者的155例樣本，其中胸腔積液55例，血液52例，腫瘤組織48例。130例患者檢測(cè)1種樣本，15例患者檢測(cè)》2種樣本。本研究經(jīng)過(guò)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2018KT105），患者均簽署知情同意書(shū)。二、實(shí)驗(yàn)方法DNA提?。盒厍环e液10ml，離心分離出上清。靜脈血4~5ml，離心分離出血漿。使用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒（美國(guó)Qiagen公司），從胸腔積液上清和血漿中提取循環(huán)游離DNA（circulatingcellfreeDNA,cfDNA）。腫瘤組織樣本經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)，至少包含＞20%的腫瘤細(xì)胞。使用QIAampDNA迷你試劑盒（美國(guó)Qiagen公司），從腫瘤組織中提取DNA。文庫(kù)構(gòu)建：從腫瘤組織中提取的DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的主要步驟包括：（1）DNA片段化。（2）文庫(kù)定量：采用QubitdsDNAHSAssayKit熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)片段化純化產(chǎn)物進(jìn)行定量，產(chǎn)物濃度應(yīng)高于2ng/以。采用Agilent21Bioanalyzer生物分析儀檢測(cè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度分布范圍，DNA片段主帶在2~250bp左右。（3）末端修復(fù)及加"A"。（4）接頭連接。（5）純化。（6）利用非捕獲聚合酶鏈反應(yīng)（non-capture-polymerasechainreaction,Non-C-PCR）進(jìn)行富集。（7）Non-C-PCR產(chǎn)物純化。（8）文庫(kù)質(zhì)控。從胸腔積液上清和血漿中提取的DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建則省去前兩個(gè)步驟。下一代測(cè)序（nextgenerationsequencing,NGS）:由北京吉因加科技有限公司完成，NGS檢測(cè)涵蓋了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中常見(jiàn)的1021個(gè)腫瘤相關(guān)基因。采用SeqCapEZLibrary對(duì)1021個(gè)基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集，按照ruSeqPEClusterGenerationKitv3和TruSeqSBSKitv3試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求對(duì)富集文庫(kù)進(jìn)行處理后，在IlluminaHiSeq30測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)質(zhì)控：即通過(guò)NCfilter軟件過(guò)濾測(cè)序過(guò)程中的低質(zhì)量reads（指測(cè)序儀單次測(cè)序所得到的堿基序列），收集原始下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控信息，然后使用realSeq軟件對(duì)被檢測(cè)樣本中攜帶的UID（UserIdentification信息進(jìn)行糾錯(cuò)和標(biāo)記。數(shù)據(jù)比對(duì)：⑴通過(guò)BWA軟件MEM模塊將得到的高質(zhì)量reads比對(duì)到人類(lèi)基因組，并通過(guò)Picard軟件的MarkDuplicates模塊對(duì)白細(xì)胞對(duì)照樣本的PCR重復(fù)等人為因素導(dǎo)致的重復(fù)reads進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)realSeq軟件對(duì)樣本中的PCR重復(fù)進(jìn)行基于UID信息的聚簇標(biāo)記，并通過(guò)聚簇情況對(duì)測(cè)序引入的錯(cuò)誤堿基進(jìn)行糾正和堿基質(zhì)量值修飾。⑵通過(guò)GATK軟件的RealignerTargetCreator模塊和IndelRealignment模塊對(duì)重點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行重新比對(duì)，并通過(guò)GATK軟件的BaseRecalibrator模塊對(duì)堿基測(cè)序質(zhì)量值進(jìn)行重新校正。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間率的比較采用為檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，顯著性檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。結(jié)果在基因檢出方面胸腔積液上清比血漿具有更高的敏感性：與血漿比較，胸腔積液上清的突變檢出率更高(P<0.05)，胸腔積液上清和腫瘤組織的最大體細(xì)胞等位基因頻率(maximumsomaticallelefrequency,MSAF)和基因拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,CNV)更高均P<0.05);與腫瘤組織比較，胸腔積液上清的突變檢出率、MSAF和CNV差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義均P>0.05，表1)?？梢?jiàn)在基因檢出方面，胸腔積液上清比血漿具有更高的敏感性，與肺癌組織相當(dāng)。寂成既社S引唾眼嶙蘊(yùn)黜飄的城陶臨M弧械2.30旭55十眼F：瞅股匏3底魅刎:彰猴累與歧蝶啊島整叮1表1胸腔積液上清與腫瘤組織、血漿基因檢出情況的比較(%)胸腔積液上清中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)突變的檢出率更高：勘雌鼬者醮破序與浦救瞰勵(lì)期眥酬憾陶嘛mbrmm婭ROS1船RET船MEirs奇tM18S00噂鄒顧4.17108D117礎(chǔ)現(xiàn)甌J5551.82*1.83取13S：曲：磁理掰漩:觸排勰旃RET：觥卦時(shí)甌球飄酹.敏成氓眺表2肺腺癌患者胸腔積液上清與腫瘤組織、血漿驅(qū)動(dòng)基因檢出率的比較(%)胸腔積液上清和血漿配對(duì)樣本分析驗(yàn)證胸腔積液上清基因突變檢測(cè)的優(yōu)越性：為驗(yàn)證上述結(jié)果，選擇同時(shí)有胸腔積液上清液和血漿配對(duì)樣本的患者共5例進(jìn)行具體分析。5例患者的胸腔積液上清檢測(cè)到27個(gè)突變，其中SNV21個(gè)，CNV6個(gè)；血漿檢測(cè)到18個(gè)突變，其中SNV18個(gè)，CNV無(wú)檢出(表3)。胸腔積液上清液和血漿所有基因突變檢出的一致率為18.52%(5/27)。此結(jié)果進(jìn)一步表明，胸腔積液上清在基因突變的檢出上優(yōu)于血漿，尤其是CNV的檢出。S35瓣艇.船盼屈呷站贏ffltl漿聊愁1?國(guó)瓣2雌瀏砰共概受湄21L85IGu0&0鄒Lfl5nB由帥:祝酸^；m'：息螭表35例肺腺癌患者胸腔積液上清液和血漿配對(duì)樣本的基因突變檢出情況（個(gè)）討論隨著靶向治療在肺癌的臨床治療上不斷取得進(jìn)展，分子病理診斷在肺癌臨床治療中的指導(dǎo)作用日益突顯。對(duì)于不能通過(guò)手術(shù)或穿刺獲取組織標(biāo)本的肺癌患者，探索其他便捷、可靠的檢測(cè)樣本勢(shì)在必行，包括血漿、胸腔積液、穿刺細(xì)胞學(xué)懸液、支氣管肺泡灌洗液、痰液和腦轉(zhuǎn)移后腦脊液等［6,7,8］大部分肺腺癌患者會(huì)伴隨胸膜腔積液的病理性積聚，即胸腔積液［9］。胸腔積液通過(guò)穿刺術(shù)就可以獲得，提取胸腔積液上清或者沉渣中的DNA，獲得包括SNV、小片段插入與刪除、融合及CNV等突變信息，可以反映患者的基因圖譜特征，在不能獲取腫瘤組織時(shí)可作為基因檢測(cè)的潛在替代樣本［10,11］。有研究表明，晚期肺腺癌患者常出現(xiàn)出血性胸腔積液，血細(xì)胞在胸腔積液中的存在會(huì)干擾腫瘤突變的檢測(cè)，但與胸腔積液沉渣不同的是，胸腔積液上清提取的cfDNA受非腫瘤細(xì)胞成分影響較?。?2］，故本研究中采用的是胸腔積液上清這一樣本類(lèi)型。在基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用中，尤其是對(duì)尋找用藥機(jī)會(huì)的腫瘤患者，主要關(guān)注基因的單核苷酸突變、CNV及融合檢出情況，這些均可作為相關(guān)靶向用藥的有力證據(jù)。在相同測(cè)序芯片覆蓋及平臺(tái)條件下，可通過(guò)靶向藥物相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因的檢出率、染色體水平的CNV檢出率等來(lái)評(píng)價(jià)基因檢出效力。上海長(zhǎng)征醫(yī)院的一項(xiàng)研究顯示，對(duì)晚期肺腺癌患者采用血液檢測(cè)和組織進(jìn)行基因檢測(cè)的一致性高達(dá)95%，通過(guò)比較兩種樣本的所有基因分類(lèi)和驅(qū)動(dòng)基因的檢出情況，確認(rèn)了血液基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值［13］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于肺腺癌患者，胸腔積液上清在MSAF和CNV檢出上與腫瘤組織無(wú)明顯差異，但高于血漿，提示胸腔積液上清中含有更多腫瘤來(lái)源的DNA，可以提供更多的基因突變信息。對(duì)EGFR、BRAFV6E、Erb-B2、ALK融合、ROS1融合、RET融合等具體驅(qū)動(dòng)基因，胸腔積液上清EGFR基因突變檢出率高于血漿分別為61.82%和38.46%），表明從胸腔積液上清中分離出來(lái)的cfDNA可以有效提供個(gè)體腫瘤的重要基因組信息，當(dāng)難以獲取腫瘤組織時(shí)，胸腔積液上清可以作為替代，且優(yōu)于血漿。除了肺癌外，胸腔積液還經(jīng)常出現(xiàn)在晚期乳腺癌［14］、胃腸道癌和卵巢癌［15］中，通過(guò)進(jìn)一步的比較研究有望揭示胸腔積液上清cfDNA在這些癌種中與類(lèi)似的診斷潛力。另外，不同節(jié)點(diǎn)的胸腔積液樣本收集，也將提高基因突變檢測(cè)在臨床的廣泛應(yīng)用。本研究有一定的局限性。（1）樣本量較小。（2）本研究中，每例患者的腫瘤組織、血漿、胸腔積液樣本并非在同一時(shí)間點(diǎn)獲取。因此，尚不能客觀而完美地揭示不同樣本之間突變信息的關(guān)系?？傊?，基于NGS技術(shù)，肺腺癌患者胸腔積液上清與腫瘤組織作為基因突變檢測(cè)樣品的臨床意義相當(dāng)，能提供比血漿樣品更全面的突變信息和更高的MSAF，具有較高的可靠性和有效性，可以作為NSCLC基因檢測(cè)的理想替代樣本。參考文獻(xiàn)ZhengRS,ZhangSW,ZengHM,etal.CancerincidenceandmortalityinChina,2016[J].JNatCancerCenter,2，02(1):1-9.DOI10.1016/j.jncc.2022.02.2.CaoMM,ChenWQ.EpidemiologyoflungcancerinChina[J].ThoracCancer,2019,10(1):3-7.DOI:10.1111/1759-7714.12916.TongL,DingN,TongX,etal.Tumor-derivedDNAfrompleuraleffusionsupernatantasapromisingalternativetotumortissueingenomicprofilingofadvancedlungcancer[J].Theranostics,2019,9(19):5532-5541.DOI:10.7150/thno.34070.JenkinsS,YangJC,RamalingamSS,etal.PlasmactDNAanalysisfordetectionoftheEGFRT790Mmutationinpatientswithadvancednon-smallcelllungcancer[J].JThoracOncol,2017,12:(7)1061-1070.DOI:10.1016/j.jtho.2017.04.3.WangMC,WangCL,ChenTL,etal.PredictingoutcomesofEGFR-targetedtherapyinnon-smallcelllungcancerpatientsusingpleuraleffusionssamplesandpeptidenucleicacidprobeassay[J].ClinChemLabMed,2017,55(12):1979-1986.DOI:10.1515/cclm-2016-0809.張智慧，吳希蘭，應(yīng)建明，等.細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR、KRAS突變的探討[J].中國(guó)肺癌雜志，2015,18(4)：199-205.DOI:10.3779/j.issn.19-3419.2015.04.05.ZhangZH,WuXL,YingJM,etal.ClinicalresearchofEGFRandKRASmutationinfineneedleaspirationcytologyspecimensofnon-smallcelllungcarcinoma[J].ChinLUngCancer,2015,18(4)：199-205.DOI:10.3779/j.issn.19-3419.2015.04.05.SunPL,JinY,KimH,etal.HighconcordanceofEGFRmutationstatusbetweenhistologicandcorrespondingcytologicspecimensoflungadenocarcinomas[J].CancerCytopathol,2013,121(6):311-319.DOI:10.12/cncy.21260.HurJY,LeeJS,KimIA,etal.Extracellularvesicle-basedEGFRgenotypinginbronchoalveolarlavagefluidfromtreatment-naivenon-smallcelllungcancerpatients[J].TranslLungCancerRes,2019,8(6)：1051-1060.DOI:10.21037/tlcr.2019.12.16.JanyB,WelteT.Pleuraleffusioninadults-etiology,diagnosis,andtreatment[J].DtschArzteblInt,2019,116(21):377-386.DOI:10.3238/arztebl.2019.0377.ShuY,WuX,TongX,etal.CirculatingtumorDNAmutationprofilingbytargetednextgenerationsequencingprovidesguidanceforpersonalizedtreatmentsinmultiplecancertypes[J].SciRep,2017,7(1：)583.DOI:10.1038/s41598-017-520-1.SeedG,YuanW,MateoJ,etal.Genecopynumberestimationfromtargetednext-generationsequencingofprostatecancerbiopsies:analyticvalidationandclinicalqualification[J].ClinCancerRes,2017,23(20):6070-6077.DOI:10.1158/1078-0432.CCR-17-0972.OzcakarB,MartinezCH,MoriceRC,etal.Doespleuralfluidappearancereallymatter?Therelationshipbetweenfluidappearanceandcytology,cellcounts,and