胸腔積液在肺腺癌基因檢測中的應(yīng)用研究

2022胸腔積液在肺腺癌基因檢測中的應(yīng)用研究前言肺癌最常見的病理類型包括腺癌、鱗癌和小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌所占的比例最高，且發(fā)病率呈上升趨勢［1］。在肺癌的診斷及治療過程中，持續(xù)監(jiān)測患者基因突變情況對非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者的靶向治療具有重要意義。但臨床上晚期NSCLC患者不能通過手術(shù)獲取腫瘤組織，部分患者行活檢獲取腫瘤組織樣本比較困難，而且無論是通過支氣管鏡對肺部病灶進(jìn)行穿刺，還是在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮行肺部病灶穿刺，均具有侵入性。氣管鏡穿刺，除涉及到麻醉用藥外，放置氣管鏡的過程中患者可能有氣管收窄、含氧量下降的情況。超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺有可能導(dǎo)致出血和氣胸。反復(fù)進(jìn)行入侵性有創(chuàng)的方式采集患者組織樣本，實(shí)難可取。因此，探索能夠安全、無創(chuàng)和可重復(fù)獲取的檢測樣本具有重要的臨床意義，血液、胸腔積液等液體活檢則具有這些優(yōu)勢［2,3,并且其樣本基因突變的檢測也顯示出良好的靈敏度和特異度［4,5。在本研究中，我們比較了胸腔積液與組織、血漿樣本的基因檢出情況，對胸腔積液作為NSCLC基因檢測的可替代性樣本進(jìn)行了評價(jià)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。資料與方法一、病例選擇和樣本獲取本研究為回顧性研究，納入了2015年2月至2019年12月經(jīng)病理確診為肺腺癌的患者145例，其中來自北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院129例，北京市房山區(qū)第一醫(yī)院16例；男72例，女73例；年齡30~94歲，中位年齡60歲。吸煙者36例，不吸煙者58例，吸煙史不詳者51例。從標(biāo)本庫中共獲取145例患者的155例樣本，其中胸腔積液55例，血液52例，腫瘤組織48例。130例患者檢測1種樣本，15例患者檢測》2種樣本。本研究經(jīng)過北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院評審委員會批準(zhǔn)（審批號：2018KT105），患者均簽署知情同意書。二、實(shí)驗(yàn)方法DNA提?。盒厍环e液10ml，離心分離出上清。靜脈血4~5ml，離心分離出血漿。使用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒（美國Qiagen公司），從胸腔積液上清和血漿中提取循環(huán)游離DNA（circulatingcellfreeDNA,cfDNA）。腫瘤組織樣本經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)，至少包含＞20%的腫瘤細(xì)胞。使用QIAampDNA迷你試劑盒（美國Qiagen公司），從腫瘤組織中提取DNA。文庫構(gòu)建：從腫瘤組織中提取的DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建的主要步驟包括：（1）DNA片段化。（2）文庫定量：采用QubitdsDNAHSAssayKit熒光定量檢測試劑盒對片段化純化產(chǎn)物進(jìn)行定量，產(chǎn)物濃度應(yīng)高于2ng/以。采用Agilent21Bioanalyzer生物分析儀檢測產(chǎn)物的長度分布范圍，DNA片段主帶在2~250bp左右。（3）末端修復(fù)及加"A"。（4）接頭連接。（5）純化。（6）利用非捕獲聚合酶鏈反應(yīng)（non-capture-polymerasechainreaction,Non-C-PCR）進(jìn)行富集。（7）Non-C-PCR產(chǎn)物純化。（8）文庫質(zhì)控。從胸腔積液上清和血漿中提取的DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建則省去前兩個(gè)步驟。下一代測序（nextgenerationsequencing,NGS）:由北京吉因加科技有限公司完成，NGS檢測涵蓋了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中常見的1021個(gè)腫瘤相關(guān)基因。采用SeqCapEZLibrary對1021個(gè)基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集，按照ruSeqPEClusterGenerationKitv3和TruSeqSBSKitv3試劑盒說明書的要求對富集文庫進(jìn)行處理后，在IlluminaHiSeq30測序平臺上進(jìn)行測序。原始數(shù)據(jù)質(zhì)控：即通過NCfilter軟件過濾測序過程中的低質(zhì)量reads（指測序儀單次測序所得到的堿基序列），收集原始下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控信息，然后使用realSeq軟件對被檢測樣本中攜帶的UID（UserIdentification信息進(jìn)行糾錯(cuò)和標(biāo)記。數(shù)據(jù)比對：⑴通過BWA軟件MEM模塊將得到的高質(zhì)量reads比對到人類基因組，并通過Picard軟件的MarkDuplicates模塊對白細(xì)胞對照樣本的PCR重復(fù)等人為因素導(dǎo)致的重復(fù)reads進(jìn)行標(biāo)記。通過realSeq軟件對樣本中的PCR重復(fù)進(jìn)行基于UID信息的聚簇標(biāo)記，并通過聚簇情況對測序引入的錯(cuò)誤堿基進(jìn)行糾正和堿基質(zhì)量值修飾。⑵通過GATK軟件的RealignerTargetCreator模塊和IndelRealignment模塊對重點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行重新比對，并通過GATK軟件的BaseRecalibrator模塊對堿基測序質(zhì)量值進(jìn)行重新校正。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間率的比較采用為檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，顯著性檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。結(jié)果在基因檢出方面胸腔積液上清比血漿具有更高的敏感性：與血漿比較，胸腔積液上清的突變檢出率更高(P<0.05)，胸腔積液上清和腫瘤組織的最大體細(xì)胞等位基因頻率(maximumsomaticallelefrequency,MSAF)和基因拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,CNV)更高均P<0.05);與腫瘤組織比較，胸腔積液上清的突變檢出率、MSAF和CNV差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義均P>0.05，表1)?？梢娫诨驒z出方面，胸腔積液上清比血漿具有更高的敏感性，與肺癌組織相當(dāng)。寂成既社S引唾眼嶙蘊(yùn)黜飄的城陶臨M弧械2.30旭55十眼F：瞅股匏3底魅刎:彰猴累與歧蝶啊島整叮1表1胸腔積液上清與腫瘤組織、血漿基因檢出情況的比較(%)胸腔積液上清中表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)突變的檢出率更高：勘雌鼬者醮破序與浦救瞰勵(lì)期眥酬憾陶嘛mbrmm婭ROS1船RET船MEirs奇tM18S00噂鄒顧4.17108D117礎(chǔ)現(xiàn)甌J5551.82*1.83取13S：曲：磁理掰漩:觸排勰旃RET：觥卦時(shí)甌球飄酹.敏成氓眺表2肺腺癌患者胸腔積液上清與腫瘤組織、血漿驅(qū)動基因檢出率的比較(%)胸腔積液上清和血漿配對樣本分析驗(yàn)證胸腔積液上清基因突變檢測的優(yōu)越性：為驗(yàn)證上述結(jié)果，選擇同時(shí)有胸腔積液上清液和血漿配對樣本的患者共5例進(jìn)行具體分析。5例患者的胸腔積液上清檢測到27個(gè)突變，其中SNV21個(gè)，CNV6個(gè)；血漿檢測到18個(gè)突變，其中SNV18個(gè)，CNV無檢出(表3)。胸腔積液上清液和血漿所有基因突變檢出的一致率為18.52%(5/27)。此結(jié)果進(jìn)一步表明，胸腔積液上清在基因突變的檢出上優(yōu)于血漿，尤其是CNV的檢出。S35瓣艇.船盼屈呷站贏ffltl漿聊愁1?國瓣2雌瀏砰共概受湄21L85IGu0&0鄒Lfl5nB由帥:祝酸^；m'：息螭表35例肺腺癌患者胸腔積液上清液和血漿配對樣本的基因突變檢出情況（個(gè)）討論隨著靶向治療在肺癌的臨床治療上不斷取得進(jìn)展，分子病理診斷在肺癌臨床治療中的指導(dǎo)作用日益突顯。對于不能通過手術(shù)或穿刺獲取組織標(biāo)本的肺癌患者，探索其他便捷、可靠的檢測樣本勢在必行，包括血漿、胸腔積液、穿刺細(xì)胞學(xué)懸液、支氣管肺泡灌洗液、痰液和腦轉(zhuǎn)移后腦脊液等［6,7,8］大部分肺腺癌患者會伴隨胸膜腔積液的病理性積聚，即胸腔積液［9］。胸腔積液通過穿刺術(shù)就可以獲得，提取胸腔積液上清或者沉渣中的DNA，獲得包括SNV、小片段插入與刪除、融合及CNV等突變信息，可以反映患者的基因圖譜特征，在不能獲取腫瘤組織時(shí)可作為基因檢測的潛在替代樣本［10,11］。有研究表明，晚期肺腺癌患者常出現(xiàn)出血性胸腔積液，血細(xì)胞在胸腔積液中的存在會干擾腫瘤突變的檢測，但與胸腔積液沉渣不同的是，胸腔積液上清提取的cfDNA受非腫瘤細(xì)胞成分影響較小［12］，故本研究中采用的是胸腔積液上清這一樣本類型。在基因檢測的臨床應(yīng)用中，尤其是對尋找用藥機(jī)會的腫瘤患者，主要關(guān)注基因的單核苷酸突變、CNV及融合檢出情況，這些均可作為相關(guān)靶向用藥的有力證據(jù)。在相同測序芯片覆蓋及平臺條件下，可通過靶向藥物相關(guān)驅(qū)動基因的檢出率、染色體水平的CNV檢出率等來評價(jià)基因檢出效力。上海長征醫(yī)院的一項(xiàng)研究顯示，對晚期肺腺癌患者采用血液檢測和組織進(jìn)行基因檢測的一致性高達(dá)95%，通過比較兩種樣本的所有基因分類和驅(qū)動基因的檢出情況，確認(rèn)了血液基因檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值［13］。本研究結(jié)果顯示，對于肺腺癌患者，胸腔積液上清在MSAF和CNV檢出上與腫瘤組織無明顯差異，但高于血漿，提示胸腔積液上清中含有更多腫瘤來源的DNA，可以提供更多的基因突變信息。對EGFR、BRAFV6E、Erb-B2、ALK融合、ROS1融合、RET融合等具體驅(qū)動基因，胸腔積液上清EGFR基因突變檢出率高于血漿分別為61.82%和38.46%），表明從胸腔積液上清中分離出來的cfDNA可以有效提供個(gè)體腫瘤的重要基因組信息，當(dāng)難以獲取腫瘤組織時(shí)，胸腔積液上清可以作為替代，且優(yōu)于血漿。除了肺癌外，胸腔積液還經(jīng)常出現(xiàn)在晚期乳腺癌［14］、胃腸道癌和卵巢癌［15］中，通過進(jìn)一步的比較研究有望揭示胸腔積液上清cfDNA在這些癌種中與類似的診斷潛力。另外，不同節(jié)點(diǎn)的胸腔積液樣本收集，也將提高基因突變檢測在臨床的廣泛應(yīng)用。本研究有一定的局限性。（1）樣本量較小。（2）本研究中，每例患者的腫瘤組織、血漿、胸腔積液樣本并非在同一時(shí)間點(diǎn)獲取。因此，尚不能客觀而完美地揭示不同樣本之間突變信息的關(guān)系。總之，基于NGS技術(shù)，肺腺癌患者胸腔積液上清與腫瘤組織作為基因突變檢測樣品的臨床意義相當(dāng)，能提供比血漿樣品更全面的突變信息和更高的MSAF，具有較高的可靠性和有效性，可以作為NSCLC基因檢測的理想替代樣本。參考文獻(xiàn)ZhengRS,ZhangSW,ZengHM,etal.CancerincidenceandmortalityinChina,2016[J].JNatCancerCenter,2，02(1):1-9.DOI10.1016/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