ABI7500熒光定量PCR儀標準操作規(guī)程

ABI7500熒光定量PCR儀標準操作規(guī)程第第頁共10頁1.目的為規(guī)范使用人正確和正常的使用ABI7500型核酸擴增熒光定量檢測儀，保證擴增及結果分析的標準化、規(guī)范化，特制定本規(guī)程。2.適用范圍適用于本公司ABI7500熒光定量PCR儀的操作。3.職責3.1使用人員負責本規(guī)程的實施。3.2設備使用人負責設備維護保養(yǎng)工作；設備責任人負責設備的定期維護保養(yǎng)工作。3.3質量監(jiān)督員負責監(jiān)督本規(guī)程的實施。內容4.1程序設置4.1.1打開電腦及儀器電源，待儀器電源項顯示power綠色狀態(tài)。4.1.2雙擊電腦桌面上的7500softwareV2.3圖標打開程序，打開程序單擊OK，待軟件連接儀器并測試校準狀態(tài)后（若有出現連接失敗可嘗試重啟電腦，檢查USB線接口），出現如下界面，單擊DesignWizard選項，紅色箭頭指示位置有個下拉菜單，如下圖所示。下拉菜單中有一個AdvancedSetup（高級設置）選項，如箭頭所示：點擊這個選項，可以進入下面這個界面，③②①③②①如上圖所示，紅色箭頭從上到下指示的分別是①實驗名稱、②儀器型號和③反應程序類型。（帶*號的必需填）③②①③②①此圖是上面圖的延續(xù)（自己電腦顯示不完全），紅色箭頭從上到下指示的分別是①PlateSetup選項、②探針類型和③程序應用速度類型，一般使用的探針就是TaqMan探針，速度類型選擇默認就可以了（如果是7500fast的話則有快速模式可以選擇）。下一步我們可以看到左上角的紅色箭頭指示的一個PlateSetup選項，點擊這個選項，就可以進入下一個設置界面。⑩①⑨⑧①⑧⑥①⑥⑤①⑦⑨①⑤④①④⑦①③①②①①⑩①⑨⑧①⑧⑥①⑥⑤①⑦⑨①⑤④①④⑦①③①②①①紅色箭頭①和②指的是設定反應探針和反應樣品名稱，箭頭③處可以填寫反應探針名稱（如P1,HBV,HCV）。箭頭⑤是選擇報告熒光，一般使用的發(fā)光基團是FAM，箭頭⑥是選擇粹滅熒光，達安現在使用的是TAMRA熒光，科華現在使用的是BHQ，在這個儀器中無此選擇項，那么就選擇none。箭頭⑧處可以填寫樣品名稱。點擊箭頭④和箭頭⑨處可以添加反應探針體系名稱和樣品名稱。箭頭⑦和箭頭⑩是選擇對應探針體系和對應樣品的曲線顏色，可選擇也可以不選。（另：探針跟樣品設定后可保存，方便以后實驗調用，具體是點擊箭頭①②下面的SavedTaeget，下次調用則點擊AddSaved就可調出。）為了方便講解，我假定有1個反應探針DAAN和1個樣本HBV1，如上圖所示。設定完成之后，我們點擊紅色箭頭所指的選項，進入下個界面。在上圖，我們可以看到一個類似反應板的界面，黑色箭頭①指示的有玫瑰紅色下劃線那一排在選定反應孔后會顯示出樣本孔總數，標準品總數和陰性對照總數。從黑色箭頭②可以看出暫時還有48個反應孔空余。藍色箭頭①和②分別是放大這個孔板界面的按鈕，藍色箭頭③是顯示大小還原默認設置按鈕。開始設置時，首先我們如紅色箭頭①所示選定A1孔，紅色箭頭②指示的是反應探針名稱，紅色箭頭③指示的樣品類型，選定反應體系后可以在U——未知樣本，S——標準樣本，N——陰性樣本中選擇一個。紅色箭頭⑤是個下拉菜單可以選擇反應探針，在紅色箭頭④指示的框里單擊鼠標，顯示打鉤就說明選定了反應體系。紅色箭頭⑥指示的是樣品名稱，紅色箭頭⑧是個下拉菜單可以選擇樣品名稱。在紅色箭頭⑦指示的框里單擊鼠標，顯示打鉤就說明選定了樣品名稱。紅色箭頭⑨指示的參比熒光，儀器默認是ROX，但是產品一般沒有添加ROX熒光，所以必須選擇None。紅色箭頭⑩指示的定量標準品的設置，可根據標準曲線的值從4567升序或是從7654降序的排列，單擊可彈出以下界面，具體如下。⑤④①④①③①②①①⑤④①④①③①②①①上圖中，紅色箭頭①表示標準品的數量，②表示標準品是否走重復孔，③表示起始的濃度，④表示10×的話則為升序，按照4567的濃度；1:10的話則為降序，按照7654的濃度。例如：做了4個標準品，每個標準品做1個（即沒有做復孔），起始濃度為10000，選擇10×，選擇箭頭⑤的自己選擇孔位，點擊左下角的Apply，則在第10排按照4567次方的順序排列。此外也可以選擇鼠標雙擊類似反應孔板的那個界面，會出現下面這個界面：⑤①④①③①①②①⑤①④①③①①②①如上圖所示，選定反應孔雙擊后會出現這樣一個界面，紅色箭頭①指示的Task—樣品反應類型，紅色箭頭②是指示的是Target—反應探針，紅色箭頭③指示的是Sample—樣品名稱。這三個都是下拉菜單，可以選擇前面設置好的反應體系和樣品名稱。紅色箭頭④是個文本框，可以備注樣本的詳細信息。按照樣本放置的實際情況設置好之后，可以點擊紅色箭頭⑤指示的RunMethod選項進入下個界面。⑦①③①⑥③①⑤③①②③①④③①⑦①③①⑥③①⑤③①②③①④③①①③①③①上圖的箭頭①是設定反應體系體積的，箭頭②是添加反應程序階段的，箭頭③是添加反應程序步驟的，箭頭⑤和⑥是制訂收集熒光信號的標志，例如箭頭⑥所示高亮顯示時表示在此步驟收集熒光信號。（切記，收集熒光只能1個地方，若是出現2個收集熒光信號的，則軟件上會有出現藍色的錯誤提示）設定好循環(huán)條件，就可以進行模板保存，以便下次實驗時調用程序，點擊位于軟件中間最右方的鍵（注：這個鍵是由于本人電腦不是寬屏的（14寸acer。。。），如果是AB配的E6500電腦則可以在軟件上全部顯示，不會出現鍵或是那些滑動條，但是。。字體會小點，，），選擇保存運行的模板，命名。下次實驗使用的時候就不用再在設條件，直接點擊openrunmethod，調出你所需要做的實驗的擴增條件。還有上圖左方的reactionsetup（反應體系設置）和materialslist（耗材清單）不需要我們去設置。點擊箭頭⑦所指的run進入運行界面。⑤④⑦①③①④⑦①③①③⑦①③①②㈡⑤④⑦①③①④⑦①③①③⑦①③①②㈡②⑦①③①①⑦①③①直接點擊上圖中的綠色START按鈕，根據提示保存實驗文件后開始實驗，實驗開始后在綠色START按鈕右方可出現實驗的預計剩余時間。箭頭②表示的是實時的曲線圖譜，③表示的是實時的溫度曲線圖譜，④表示的是實驗的條件。實驗結束后按箭頭⑤所指的分析，出現以下界面。⑧①⑤④⑦①③①⑦⑤④⑦①③①⑥⑦⑤④⑦①③①②⑤④⑦①③①③⑤④⑦①③①⑤④⑦①③①⑧①⑤④⑦①③①⑦⑤④⑦①③①⑥⑦⑤④⑦①③①②⑤④⑦①③①③⑤④⑦①③①⑤④⑦①③①④⑤④⑦①③①①⑤④⑦①③①做完實驗后，曲線會出現在上圖，以對數圖譜的形式出現，若想換為線性圖譜，可點擊箭頭①所指示的去選擇log或linear，其次，再點擊箭頭⑧的分析按鈕（有實驗數據的話會出現的是analysis），樣本的結果跟CT會在右邊的96孔面板中出現，上面的顯示不完全，曲線的基線baseline跟閾值threshold設置是在上圖數字⑦下面的那個地方（不是箭頭⑦所指的地方），進行設置。箭頭③表示的是實驗標準曲線的參數。箭頭④⑤表示的是每個孔的原始光譜圖。箭頭⑥表示的是一些附加的報警信息，例如重復孔偏差了，熒光偏差了，質控失控了。箭頭⑦表示的是上面4中圖譜的集合，可自己選擇組合查看。4.1.3實驗結束后填寫《設備使用記錄》4.2結果分析4.2.1在analysissetup里面修改各個探針的baseline與threshold數值，點擊綠色analyze圖標，軟件及完成自動分析。4.2.2在amplificationplot界面查看所有樣品的擴增曲線。4.2.3整體曲線的觀察,將所有曲線選中進行整體觀察。4.2.3.1觀察是否存在污染情況（包括標本污染和試劑污染），特別應注意大量曲線在同一Ct值出現上漲的情況。4.2.3.2觀察是否有光路傳導阻滯或電壓波動等機器原因形成的異常曲線。4.2.4對照、質控品、標準品的分析4.2.4.1陰性對照：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知陰性標本。作用：用以監(jiān)測實驗室和前處理過程中是否存在污染。4.2.4.2陽性對照：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知陽性標本。作用：用以監(jiān)測實驗能否正常檢出陽性標本，避免假陰性的出現。4.2.4.3陽性室內質控品的分析：陽性室內質控品：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知或未知濃度的陽性室內質控血清。作用：用以監(jiān)控日常實驗的精密度。4.2.4.4陽性標準品的分析：各梯度曲線的分布是否均勻，若各梯度曲線均未分開，則表明陽性標準品稀釋可能存在問題，提示實驗中存在較大人為誤差。4.2.4.5觀察各曲線的Ct值是否在平日的正常位置：若出現低拷貝標準品做不出，而各曲線Ct值均后移，則判斷是否為試劑擴增效率下降（如試劑過期或保存條件不合格）。出現低拷貝標準品做不出，而高拷貝曲線Ct值均正常，則提示可能存在低拷貝陽性標準品的降解情況。若高拷貝標準品出現Ct值后移，且能排除上述情況，則判斷是否為試劑靈敏度下降。得出定量結果：調節(jié)基線和閾值以得到一較好的標準曲線。電腦據此曲線給出實驗結果值。4.3儀器維護4.3.1注意開機關機順序，機器開機后即可使用，無需預熱。4.3.2電腦上使用專用U盤等移動存儲設備，建議使用光盤刻錄來轉移數據。4.3.3針對電腦硬盤，進行周期性碎片整理，并將試驗數據備份到其他存儲設備上（比如光盤）4.3.4儀器表面與電腦表面應每月用軟布擦拭（無需用水，禁用有機溶劑，會溶解機器表面的漆層）。4.3.5燈泡更換：在燈泡使用達到壽命后（2000小時），或者意外損壞后需要更換。機器關閉電腦30分鐘后，打開前面上半冊面板，取出舊燈泡，在操作過程中需要戴無塵手套操作，注意燈泡高溫。然后將新燈泡，用氣吹吹掉表面的灰塵，安裝燈泡。4.3.6樣品孔清潔：樣品孔污染后會影響PCR擴增的信號，是的該孔信號高于其他孔，造成假陽性的結果，需要每月執(zhí)行background校正，針對信號值超過72000的孔，使用棉簽與去離子水進行清潔。清潔時關閉機器電源，打開前面上半面板，將熱蓋板（黑色面板）推到后面，清潔相應的孔，然后恢復原狀，重新執(zhí)行background校正，直到所有