DB21-T 2870-2017大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型PCR檢測方法

ICS11.220

B41

備案號：58553-2018DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T2870—2017

大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型

PCR檢測方法

DB21/T2870—2017

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙鳳菊，趙曉彤，李清竹，關(guān)淼，劉坤洋，關(guān)乃鵬，陳瑤，鄧文超，吳運(yùn)譜，

馬建山，趙培。

II

DB21/T2870—2017

大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型PCR檢測方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大腸桿菌ESBLs基因型的PCR檢測。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大腸桿菌ESBLs基因型的檢測，適用于

產(chǎn)ESBLs大腸桿菌ESBLsTEM、CTX-M、SHV和OXA4種基因型的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號（《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》）

3縮略語

下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

E.coli：大腸桿菌（Escherichiacoli）

ESBLs：超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrumbeta-lactamase）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

DNase：脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）

bp：堿基對（basepair）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

TE緩沖液：TE緩沖液（Tris-EDTAbuffersolution）

TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）

4原理

根據(jù)E.coliESBLs的TEM、CTX-M、SHV和OXA基因序列設(shè)計(jì)四對特異性引物，在DNA聚合酶催化下，

以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈

DNA。

5儀器和器材

1

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5.1高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（離心范圍0～20000r/min）

5.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。

5.3PCR擴(kuò)增儀

5.4電泳儀

5.5凝膠成像系統(tǒng)

5.6微波爐

5.7分析天平

5.8離心管：15mL離心管、1.5mL離心管和0.2mLPCR專用離心管。

5.9微量可調(diào)移液器：1000μL，200μL，100μL，50μL，20μL，10μL，2μL。

6試劑和引物

注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實(shí)驗(yàn)使用的試劑等級均為不含DNA或DNase的分

析純或生化試劑；所有試劑均用無菌的容器分裝。

6.1DNA抽提試劑：DNAzol?Reagent，外觀為淡綠色，于4～8℃保存。

6.2無水乙醇：-20℃預(yù)冷。

6.375%乙醇：用無水乙醇和滅菌雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。

6.4Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。

6.5dNTP（2.5mmol/L）。

6.6陰性對照：滅菌雙蒸水。

6.7陽性對照：大腸桿菌ESBLs陽性菌株。

6.8無菌生理鹽水。

6.9TE緩沖液（pH8.0）。

6.10TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液。

6.11溴化乙錠。

6.12DL2000DNAMarker。

6.13引物

用于PCR反應(yīng)的引物濃度為20μmol/L，其序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

表1ESBLs四種基因型的PCR引物

基因型引物序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小/bp退火溫度/℃

F5’-CGATACGGGAGGGCTTAC-3’

TEM503

R5’-CGGTCGCCGCATACACTA-3’

55

F5’-AATTAGAGCGGCAGTCGG-3’

CTX-M697

R5’-GGTTGAGGCTGGGTGAAG-3’

F5’-TTATCTCCCTGTTAGCCACCCT-3’

SHV83856

R5’-TAGCGTTGCCAGTGCTCGAT-3’

F5’-CGCCAGTGCATCAACAGATA-3’

OXA70454

R5’-AATTCGACCCCAAGTTTCCT-3’

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7操作步驟

7.1樣品制備

將大腸桿菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)18～24h后，挑選典型菌落，用1mL無菌生理

鹽水制備成一定濃度的菌懸液。

7.2DNA提取

7.2.1DNA的提取按照DNAzol?Reagent提取試劑說明書進(jìn)行，并設(shè)立陽性對照、陰性對照。

7.2.2將800μLDNAzol加入1.5mL滅菌離心管中，然后分別加入被檢樣品、陽性對照和陰性對

照各200μL，顛倒混勻后，4℃12000r/min離心10min。

7.2.3然后吸取900μL上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL滅菌離心管中，再加入500μL無水乙醇混勻，

4℃12000r/min離心5min。

7.2.4棄上清，加入1mL75%乙醇，4℃12000r/min離心5min。重復(fù)洗2次。

7.2.54000r/min離心10s，用微量可調(diào)移液器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3～10min。

7.2.6加入20μLTE緩沖液或經(jīng)高壓處理的滅菌雙蒸水，輕柔混勻，溶解管壁上的DNA，冰上保存

備用；若需長期保存應(yīng)放置-70℃冰箱。

可以采用其他等效DNA提取方法或合法化商品化DNA提取試劑盒進(jìn)行操作。

7.3PCR檢測

7.3.1PCR反應(yīng)體系

建立25μL反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專用離心管中：

——滅菌蒸餾水17.375μL

——10×PCRBuffer2.5μL

——2.5mmol/LdNTP2μL

——ExTaqDNA聚合酶0.125μL

——上游特異性PCR引物0.5μL

——下游特異性PCR引物0.5μL

——DNA模板2μL

7.3.2PCR反應(yīng)條件

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火溫度根據(jù)引物進(jìn)行選擇（54℃、55℃或

56℃）退火45s，72℃延伸30s，循環(huán)35次后72℃延伸10min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

7.3.3電泳

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL與1μL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL

溴化乙錠）板點(diǎn)樣孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DL2000DNAMarker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

物），緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳25min。

8試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定

8.1試驗(yàn)成立條件

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8.1.1陰性對照

陰性對照未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。

8.1.2陽性對照

8.1.2.1TEM基因型陽性對照出現(xiàn)503bp的擴(kuò)增條帶；

8.1.2.2CTX-M基因型陽性對照出現(xiàn)697bp的擴(kuò)增條帶；

8.1.2.3SHV基因型陽性對照出現(xiàn)838bp的擴(kuò)增條帶；

8.1.2.4OXA基因型陽性對照出現(xiàn)704bp的擴(kuò)增條帶。

當(dāng)在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)符合以上條件時(shí)實(shí)驗(yàn)成立，否則實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。

8.2結(jié)果判定

在紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)成立時(shí)，如果被檢產(chǎn)ESBLs大腸桿菌出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增

條帶時(shí)，則可初步判斷被檢菌株攜帶相應(yīng)的基因型ESBLs，初步判斷為陽性結(jié)果的菌株可通過核酸

序列測定進(jìn)行確認(rèn)。如果被檢產(chǎn)ESBLs大腸桿菌未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則可判斷被檢菌株未

攜帶相應(yīng)的基因型ESBLs。

9檢測過程中防止交叉污染的措施

按照GB/T19495.2-2004的規(guī)定執(zhí)行。

10廢棄物處理

按照GB19489-2008的規(guī)定執(zhí)行。

4

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

試劑配制

A.1電泳緩沖液（50倍）

A.1.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）18.61g

滅菌雙蒸水80mL

氫氧化鈉調(diào)pH至8.0

滅菌雙蒸水加至100mL

A.1.2TAE（三羥甲基氨基甲烷一乙酸）電泳緩沖液（50倍）

羥基甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）100mL

滅菌雙蒸水加至1000mL

用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋使用。

A.2TE緩沖液（pH8.0）

A.2.11mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液

取12.11gTris置于100mL燒杯中，加入80mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓鋮s至室

溫后，用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至100mL，121℃高壓15min，室溫保存。

A.2.210倍TEBuffer

取10mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液和0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL置于

100mL燒杯中，加入80mL去離子水，均勻混合，定容至100mL后，121℃高壓15min，室溫

保存。使用時(shí)進(jìn)行10倍稀釋。

A.3溴化乙錠（EB）溶液（10μg/μL）

溴化乙錠200mg

滅菌雙蒸水20mL

A.4含0.5μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂凝膠

瓊脂糖（電泳級）1g

TAE電泳緩沖液（50倍）2mL

滅菌雙蒸水98mL

5

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微波爐中完全融化，待冷至50～55℃時(shí)，加溴化乙錠（EB）溶液5μL。

_________________________________

6

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目次

前言..............................................................................II

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件......................................................................1

3縮略語..............................................................................1

4原理................................................................................1

5儀器和器材..........................................................................1

6試劑和引物..........................................................................2

7操作步驟............................................................................3

8試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定..............................................................3

9檢測過程中防止交叉污染的措施........................................................4

10廢棄物處理.........................................................................4

附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制........................................................5

I

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