DB21-T 3054-2018犬巴貝斯蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法

ICS11.220

B41

備案號(hào)：62083-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3054—2018

犬巴貝斯蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法

DetectionoffluorescentquantitationPCRforBabesiacanis

DB21/T3054—2018

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：高志峰、張才、楊國(guó)麗、鄧文超、張健、馬建山、高原、蘭德松。

II

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犬巴貝斯蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了犬巴貝斯蟲的熒光定量PCR檢測(cè)方法的技術(shù)要求，包含規(guī)范性引用文件、縮略語(yǔ)、原

理、儀器和器材、試劑和引物、樣品的采集和前處理、操作步驟、檢測(cè)過(guò)程中防治交叉污染的措施、廢

棄物處理等。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于在生物安全Ⅱ級(jí)（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全血液樣品中犬巴貝斯蟲核酸的檢測(cè)，

適用于犬巴貝斯蟲病的確診及流行病學(xué)調(diào)查。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告2003年第302號(hào)《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告2017年第25號(hào)《病死及病害動(dòng)物無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范》

3縮略語(yǔ)

該部分對(duì)本技術(shù)規(guī)范中用到的縮略語(yǔ)進(jìn)行了注解：

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

bp：堿基對(duì)（basepair）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）

4原理

巴貝斯蟲病是指由巴貝斯科的原蟲所引起的一種梨形蟲病，主要以侵害家畜的紅細(xì)胞為特征的血液

原蟲病。犬巴貝斯蟲病是一種經(jīng)硬蜱傳播的血液原蟲病，臨床上以嚴(yán)重貧血、高熱、黃疸、呼吸困難為

特征。根據(jù)犬巴貝斯蟲（Babesiacains,B.canis）裂殖子基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在DNA聚合酶催化

下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的

子鏈DNA。

5儀器和器材

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5.1低溫高速離心機(jī)（最大離心力12000rpm）.

5.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。

5.3生物安全柜。

5.4熒光PCR擴(kuò)增儀。

5.5分析天平。

5.6離心管：1.5ml離心管和0.2mlPCR專用離心管。

5.7微量可調(diào)移液器：1000μl，200μl，100μl，50μl，20μl，10μl，2μl。

6試劑和引物

注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說(shuō)明外，所有實(shí)驗(yàn)使用的試劑等級(jí)均為不含RNA或RNase的分

析純或生化試劑；所有試劑均用無(wú)菌的容器分裝。

6.15mMol/L的Tris/HCl(pH7.5～8.0)

6.2滅菌雙蒸水

6.370%乙醇

6.4犬巴貝斯蟲陽(yáng)性對(duì)照組基因

6.5特異性引物：

正向引物：5’-TGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG-3’

反向引物：5’-TCCATGCTGAAGTATTCAAGACACA-3’。

6.6基因組DNA純化試劑盒100次、購(gòu)自TaKaRa公司，常溫保存

6.7熒光定量試劑盒FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)。產(chǎn)品在-15至-25℃條件下可穩(wěn)定

存放至標(biāo)簽上的有效期之前。若存放于2～8℃條件，僅可短期儲(chǔ)存不超過(guò)1個(gè)月。

7樣品的采集和前處理

7.1于犬前肢臂頭靜脈取300μl抗凝血，4℃保存，4h內(nèi)使用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA。將

獲得的DNA放置﹣20℃保存。

7.2采樣時(shí)避免接觸血液，盡量使用一次性采血針及配套采血管（EDTA，2Na-EDTA，肝素均可）采血。

7.3采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避

免反復(fù)凍融(凍融不超過(guò)3次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6～8h之內(nèi)運(yùn)送

到實(shí)驗(yàn)室。

7.4按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)。

8操作步驟

8.1全血基因組的提取

8.1.1按處理血液樣品數(shù)準(zhǔn)備1.5ml離心管，并各加入GenTLESolutionI500μl。

8.1.2把混合均勻的100μl血液，加入到分裝好的GenTLESolutionI的離心管中，立即振蕩數(shù)秒鐘。

不管處理多少樣品，血液加入到GenTLESolutionI中，要立即進(jìn)行振蕩混合，否則有可能降低收取

的DNA量。

2

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8.1.3室溫放置10min以上，然后在室溫條件下12000rpm離心5min。離心時(shí)，請(qǐng)注意離心管在離心

機(jī)里的擺放方向要統(tǒng)一，離心管的小耳朵朝上。此時(shí)幾乎看不到DNA沉淀。若離心溫度低，會(huì)對(duì)收取的

DNA量和純度有影響，請(qǐng)于20℃以上離心。

8.1.4用移液器小心除去管中溶液，此時(shí)沉淀看不清，緊貼在離心管外側(cè)（帶小耳朵一側(cè)）的內(nèi)壁上，

除去溶液時(shí)，請(qǐng)一定注意微量移液器吸頭不要碰到離心管外側(cè)的內(nèi)壁，插到離心管內(nèi)側(cè)的底部，注意不

要吸走沉淀物。

8.1.5加入1ml的GenTLESolutionII。此時(shí)GenTLESolutionII應(yīng)沿著離心管內(nèi)側(cè)的內(nèi)壁加入到

離心管中。特別注意操作步驟4（除去GenTlESolutionI和血液混合物）以及操作步驟10（除去GenTLE

SolutionIII和異丙醇混合物）的實(shí)驗(yàn)操作特別重要，請(qǐng)嚴(yán)格按操作方法進(jìn)行。

8.1.6輕柔地上下顛倒離心管數(shù)次，室溫12000rpm以上離心2min，用微量移液器小心地除去上清溶

液（方法參見實(shí)驗(yàn)操作4）。劇烈振蕩將影響收量和純度。

8.1.7向離心管中加入GenTLESolutionIII500μl，輕微振蕩10s充分混合。

8.1.8室溫12000rpm離心5min，把上清溶液移至另一個(gè)新的離心管中。

8.1.9加入等體積（約500μl）的異丙醇，輕柔地上下顛倒數(shù)次，均勻混合。

8.1.104℃、12000rpm離心5min，小心除去上清溶液。GenTLESolutionIII中含有影響酶反應(yīng)

的物質(zhì)，所以一定要除凈上清溶液，但應(yīng)注意不要吸走沉淀。

8.1.11加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12000rpm離心5min，小心地除去上清溶液（方法參見4）。

8.1.12干燥沉淀。因?yàn)樵摲椒ㄌ崛〉腄NA較大，完整性好，所以請(qǐng)一定不要干燥過(guò)度。Tube（離心管）

中看不到有明顯的液體或沒(méi)有乙醇?xì)馕逗螅涂梢约尤隩E進(jìn)行溶解。如果沉淀已經(jīng)變白，說(shuō)明干燥過(guò)度，

此時(shí)加入TE，可能沉淀不能完全溶解，DNA的收量可能會(huì)受到影響。

8.1.13根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)需要，用10～50μl適當(dāng)?shù)?mMol/L的Tris/HCl(pH7.5～8.0)溶解沉淀。

8.2熒光定量PCR的方法

8.2.1冰上操作。

8.2.2準(zhǔn)備0.2mlTube若干（數(shù)目為樣品數(shù)目+2）。

8.2.3向每個(gè)管中加入

（1）2×SYBRMasterMix10.0μl；

（2）20μmol/l正反向引物各0.1μl；

（3）去離子水7.8μl；

（4）樣品2μl，其中2個(gè)管分別加入2μl滅菌雙蒸水和2μl陽(yáng)性對(duì)照基因。

8.2.4震蕩混勻后使用離心機(jī)離心，此時(shí)拿出Tube時(shí)應(yīng)小心不可以讓聚集在管底的液體彈起。

8.2.5放入熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為：95℃3min，95℃15s，60℃60s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)。

8.2.6熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，從熒光定量PCR儀直接調(diào)取熒光定量PCR溶解曲線數(shù)據(jù)，進(jìn)行溶解曲線

分析。

8.3結(jié)果判定

當(dāng)樣品的熒光定量PCR溶解曲線數(shù)據(jù)與陽(yáng)性對(duì)照一致為有規(guī)律的擴(kuò)增曲線，而空白組（即雙蒸水組）

無(wú)擴(kuò)增曲線時(shí)，則樣品為檢測(cè)陽(yáng)性樣品；若當(dāng)樣品的熒光定量PCR溶解曲線數(shù)據(jù)與空白組（即雙蒸水組）

一致無(wú)擴(kuò)增曲線，而陽(yáng)性對(duì)照可見有規(guī)律的溶解曲線，則樣品為檢測(cè)陰性樣品。

9檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施

按照GB/T19495.2的規(guī)定執(zhí)行。

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10廢棄物處理

按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行。

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目次

前言..............................................................................II

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件......................................................................1

3縮略語(yǔ)..............................................................................1

4原理................................................................................1

5儀器和器材..........................................................................1

6試劑和引物..........................................................................2

7樣品的采集和前處理..................................................................2

8操作步驟............................................................................2

9檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施........................................................3

10廢棄物處理.........................................................................4

I

DB21/T3054—2018

目次

前言..............................................................................II

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...............................................................