DB21-T 3061-2018飼用微生物制劑中糞腸球菌的檢測方法

ICS65.120

B46

備案號：62091-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3061—2018

飼用微生物制劑中糞腸球菌的檢測方法

MethodfordetectionofEnterococcusfaecalisinfeedingmicrobialpreparations

DB21/T3061—2018

飼用微生物制劑中糞腸球菌的檢測方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼用微生物制劑中糞腸球菌的檢驗方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有益微生物糞腸球菌的各種飼料添加劑中糞腸球菌的檢測和計數(shù)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定

GB/T14699.1飼料采樣

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T20195動物飼料試樣的制備

3稀釋液、培養(yǎng)基及試劑

實驗用水的電導(dǎo)率在25℃時不應(yīng)超過25μS/cm(相當(dāng)于電阻率≥0.4ΜΩcm)，除非另有規(guī)定要求。水的

微生物污染不超過103CFU/mL。應(yīng)按GB4789.2執(zhí)行，采用平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，在36℃±1℃培養(yǎng)48h±2

h進行定期檢查微生物污染。

3.10.85%滅菌生理鹽水。

3.2糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.1。

3.3哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.2。

3.4革蘭氏染色液：見附錄A中A.3。

3.5革蘭氏陽性菌鑒定卡或生化鑒定試劑。

3.6PCR鑒定試劑盒。

4標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌ATCC29212。

5設(shè)備和玻璃器皿

5.1恒溫培養(yǎng)箱：精度36℃±1℃。

5.2高壓滅菌鍋：使用溫度為121℃。

1

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5.3微生物鑒定儀。

5.4渦旋儀：0r～2500r/min。

5.5麥?zhǔn)媳葷醿x：量程0MCF～5MCF。

5.6顯微鏡：放大倍數(shù)400以上。

5.7無菌采樣袋/瓶。

5.8天平：0.00g～410.00g。

5.9冰箱：2℃～8℃。

5.10離心管：裝量為50mL。

5.11玻璃或塑料平皿：直徑為90mm。

5.12L形玻璃或塑料涂布棒。

5.13吸管或移液器：容量為0.1mL、1mL、10mL。

5.14廣口瓶或三角瓶：容量為500mL。

6采樣

實驗室樣品具有真實性和代表性。采樣人應(yīng)佩帶無菌手套和口罩。采樣工具，如鏟子、匙、采樣器、

試管、廣口瓶、剪子等，應(yīng)為無菌器皿。樣品采集后置于2℃～8℃環(huán)境內(nèi)冷藏保存。采樣數(shù)量和方式按

GB/T14699.1執(zhí)行。

7試樣的制備

按GB/T20195執(zhí)行。

8操作步驟

8.1檢樣制備及稀釋

在超凈工作臺中稱取試樣25g（mL），加入盛有225mL0.85%滅菌生理鹽水的三角瓶中（瓶內(nèi)預(yù)置

適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）。置振蕩器上，振蕩30min。經(jīng)充分振搖后，采用0.85%滅菌生理鹽水進行1:10的稀

釋。用滅菌吸管吸取1:10的均勻稀釋液1mL，置于滅菌的9mL0.85%滅菌生理鹽水離心管中，密封，渦

旋儀渦旋10s，經(jīng)充分混勻后制成1:100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，按上述稀釋次序遞次稀釋至相應(yīng)要

求的稀釋倍數(shù)。

8.2接種和培養(yǎng)

選擇2個或者3個適宜的稀釋度，用滅菌吸管分別吸取0.1mL，接種到糞腸球菌瓊脂平皿（3.2）上，

每個濃度接種兩個平皿，使用無菌的涂布棒快速、準(zhǔn)確地涂布接種于培養(yǎng)基表面。涂布棒不得接觸平皿

邊緣。每個平皿用一支無菌涂布棒。涂布好的平皿蓋上平皿蓋后，室溫放置15min，使接種物完全被培

養(yǎng)基吸收為止。翻轉(zhuǎn)上述平皿置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱（4.1）中培養(yǎng)48h±1h。

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8.3菌落計數(shù)及篩選

培養(yǎng)后，選取典型菌落數(shù)在30個～300個之間的平板計數(shù)。典型糞腸球菌菌落呈圓形，表面光滑、

隆起，菌落呈黑色或淡黑色，直徑在0.5mm～2.0mm大小的菌落。然后從中選出5個特征菌落進行確證

試驗。

8.4鑒定試驗

8.4.1菌種制備

自平板上挑取單菌落，劃線轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（3.3）上，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，

從每一平板中選取至少1個良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接保存，進行生化確證試驗。

8.4.2形態(tài)觀察

將挑選純化的菌落做革蘭氏染色（3.4）鏡檢。糞腸球菌細胞應(yīng)為球形，可順鏈的方向延長，直徑

0.5μm～1.0μm，單個、大多數(shù)成雙或短鏈狀排列，革蘭氏染色陽性，無芽孢，不染色懸滴或壓滴標(biāo)本

片下通常不運動。

8.4.3生化鑒定試驗

挑取純化的菌落用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)節(jié)菌濃至0.5MFC。使用生化鑒定試劑盒、生化鑒定管或者微生物

鑒定儀按說明進行鑒定試驗。生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，如果采用的培養(yǎng)基與本標(biāo)準(zhǔn)確證試驗所用

的培養(yǎng)基一致，可以按照商品說明書使用這些試劑盒或生化鑒定管進行該項確證試驗。如果采用的培養(yǎng)

基與本標(biāo)準(zhǔn)確證試驗所用的培養(yǎng)基一致，可以使用其他鑒定儀器。如微生物鑒定儀也可進行該確證試驗。

糞腸球菌的主要生化特性見表1。

表1糞腸球菌的主要生化特性

菌名半乳糖麥芽糖葡萄糖乳糖棉籽糖甘露醇H2S吲哚甲基紅硝酸鹽

還原

糞腸++++----+-

球菌

8.4.4PCR鑒定試驗

引物：F:5’-TGCCGCATGGCATAAGAG-3’R:5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’。

預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為1097bp。反應(yīng)體系見表2。

表2PCR反應(yīng)體系

——

3

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試劑使用量（uL）

2×PCRMix緩沖液30

上游引物（20μM）1

下游引物（20μM）1

模板（100ng/μL）2

ddH2O適量

總體積50

程序設(shè)定如下：①預(yù)變性：95℃5min；②變性：95℃45s；③退火：48℃45s；④延伸：72℃45s；

⑤保溫：4℃30min。步驟②至④的循環(huán)數(shù)設(shè)為30。

9檢測結(jié)果

9.1計算每塊板上糞腸球菌菌落數(shù)

計算每塊平板上的糞腸球菌菌落數(shù)a，使用式（1）計算

b

aC………(1)

A

式中：

a——計算每塊平板上的糞腸球菌菌落數(shù)；

b——挑取后經(jīng)證實為糞腸球菌的菌落數(shù)；

A——挑取平板上用于驗證的菌落數(shù)；

C——平板上的所有特征菌落數(shù)

最終結(jié)果按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則修約至整數(shù)。

例如若某平板上有100個典型菌落，取5個鑒定，證實為糞腸球菌的是4個，則：

4

a＝×100＝80

5

9.2樣品中糞腸球菌菌數(shù)的計算方法及報告

選擇兩個連續(xù)稀釋度平板（每個稀釋度至少有一塊平板，其上經(jīng)確證后的糞腸球菌菌數(shù)介于30～300

之間），通過式（2）計算，即為1mL或1g樣品中的糞腸球菌菌數(shù)N：

a

N……(2)

Vn10.1n2d

式中：

N--------樣品中糞腸球菌菌落數(shù)；

∑a---------所有平板經(jīng)確證后的糞腸球菌菌數(shù)的總和；

V--------平板的接種體積，單位為毫升（mL）；

n1---------第一個稀釋度的平板數(shù)；

n2---------第二個稀釋度的平板數(shù)；

4

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d---------第一個稀釋度的稀釋因子（未經(jīng)稀釋的液體樣品的d值）。

按GB/T8170執(zhí)行。將計算出的結(jié)果保留至兩位有效數(shù)字，也可將樣品的糞腸球菌菌落數(shù)記錄為

1.0～9.9乘以10的指數(shù)冪表示。

報告每mL或每g樣品的糞腸球菌估計數(shù)，單位CFU/g（mL）。

5

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基和試劑

A.1糞腸球菌培養(yǎng)基

A.1.1成分（g/L）

?胨10.0

麥芽糖20.0

酵母浸粉10.0

甘油磷酸鈉10.0

氯化鈉5.0

乳糖1.0

溴甲酚紫0.015

疊氮鈉0.4

TTC0.1

瓊脂13.0

A.1.2制法

溶解各成分于水中，必要時加熱。調(diào)整pH值，使培養(yǎng)基pH值在25℃時為7.2±0.2。煮沸使用。

A.2哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基

A.2.1成分（g/L）

酪蛋白胰酶消化物10.0

心胰酶消化物3.0

玉米淀粉1.0

瓊脂13.0～15.0

肉胃酶消化物5.0

酵母浸出粉5.0

氯化鈉5.0

A.2.2制法

溶解各成分于水中，必要時加熱。調(diào)整pH值，使培養(yǎng)基pH值在20℃～25℃時為7.3±0.2。121℃

滅菌15min～20min。

A.3革蘭氏染色

A.3.1結(jié)晶紫染色液

A.3.1.1成分

結(jié)晶紫1g

95%乙醇20mL

1%草酸銨水溶液80mL

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A.3.1.2制法

將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.3.2革蘭氏碘液

A.3.2.1成分

碘1g

碘化鉀2g

蒸餾水300mL

A.3.2.2制法

將碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.3.3沙黃復(fù)染液

A.3.3.1成分

沙黃0.25g

95%乙醇10mL

蒸餾水90mL

A.3.3.2制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.3.4染色法

將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染色1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，媒染1min，

水洗，滴加95%乙醇脫色，約30s，水洗；滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，