細(xì)胞凝集反應(yīng)

山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2010年9月30日姓名程開源系年級(jí)2010級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制組別同組者科目分子細(xì)胞生物學(xué)題目細(xì)胞凝集反應(yīng)學(xué)號(hào)201000232012【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私饧?xì)胞膜的表面結(jié)構(gòu)掌握凝集素促使細(xì)胞凝集的原理學(xué)習(xí)研究細(xì)胞凝集反應(yīng)的方法【實(shí)驗(yàn)原理】凝集素是一類含糖（少數(shù)例外）并能與糖轉(zhuǎn)移結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用。目前已發(fā)現(xiàn)近千種植物中含有凝集素，在各種真菌、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物，人體的各種組織和器官中及某些病毒體內(nèi)也含有凝集素，在各種真菌、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物，人體的各種組織和器官中及某些病毒體內(nèi)也含有凝集素。常用的為植物凝集素，通常一起被提取的植物命名，如伴刀豆凝集素A、麥胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是他們的總稱。在細(xì)胞表面，組成細(xì)胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖鏈，形成細(xì)胞外被（又被稱為糖萼）。凝集素能與細(xì)胞外被中的糖分子連接，在細(xì)胞間形成“橋”，從而引起細(xì)胞凝集。凝集素引起的血細(xì)胞凝集，其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，與血液凝固中發(fā)生的復(fù)雜生物化學(xué)過程完全不同；另外，凝集素能與不同的糖蛋白特異結(jié)合，加入與凝集素互補(bǔ)的糖可以抑制細(xì)胞的凝集，但是凝集素不是來源或參與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，因此，Ponder提出應(yīng)稱“凝集素組織化學(xué)”而不能稱為“凝集素免疫組織化學(xué)”。人們利用凝集素與不同的糖蛋白特異性結(jié)合的原理，識(shí)別和研究不同類型膜結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特征，以及進(jìn)行血型鑒定。ABO血型鑒定主要用于臨床輸血，在皮膚、腎等器官移植的時(shí)候選擇ABO血型相符的供體；不孕癥和新生兒溶血癥病因的分析及親子鑒定等。另外，凝集素在臨床疾病防治、機(jī)體生理活動(dòng)調(diào)控以及生物工程等方面展示出了十分廣闊的應(yīng)用前景。如：植物凝集素可抑制受精；蕓豆凝集素可直接抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶的活性，減少HIV感染者的病毒載量；細(xì)胞膜表面糖復(fù)合物的糖鏈結(jié)構(gòu)與腫瘤細(xì)胞增殖、侵染、轉(zhuǎn)移等發(fā)展過程密切相關(guān)，凝集素芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌癥的快速、高通量檢測，有助于篩選出癌癥相關(guān)的糖鏈標(biāo)志物。下面介紹幾種細(xì)胞凝集的反應(yīng)技術(shù):直接凝集反應(yīng)技術(shù)顆粒性抗原(細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)的抗體血清混合后，在電解質(zhì)的參與下，經(jīng)過一定時(shí)間，抗原抗體凝聚成肉眼可見的凝集塊，這種現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。血清中的抗體稱為凝集素?？乖Q為凝集原。細(xì)菌或其他凝集原都帶有相同的電荷（陰電荷），在懸液中相互排斥而呈均勻的分散狀態(tài)?？乖c抗體相遇后，由于抗原和抗體分子表面存在著相互對(duì)應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，因而發(fā)生特異性結(jié)合，稱為抗原抗體復(fù)合物。由于抗體與抗原結(jié)合，降低了抗原分子間的經(jīng)典排斥力，抗原表面的親水基團(tuán)減少，由親水狀態(tài)變?yōu)槭杷疇顟B(tài)，此時(shí)已有凝集的趨向，在電解質(zhì)（如生理鹽水）參與下，由于例子的作用，中和了抗原抗體復(fù)合物外面的大部分電荷，使之是去了彼此間的經(jīng)典排斥力，分子間相互吸引，凝集成大的絮片或顆粒。出現(xiàn)了肉眼可見的凝集反應(yīng)。但是，直接凝集反應(yīng)技術(shù)還有幾個(gè)缺陷：特異性不高、抗原抗體無法獲得或無法用于實(shí)驗(yàn)。二．間接凝集反應(yīng)技術(shù)可溶性抗原（或抗體）吸附雨免疫學(xué)反應(yīng)無關(guān)的顆粒（稱為載體）表面上，當(dāng)這些致敏的顆粒與相應(yīng)的抗體（或抗原）相遇時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生特異性的結(jié)合，在電解質(zhì)參與下，這些顆粒就會(huì)發(fā)生凝集現(xiàn)象。這種借助于載體的抗原抗體凝集現(xiàn)象就叫做間接凝集反應(yīng)。載體的存在使反應(yīng)的敏感性得以大大提高。間接凝集反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)為：敏感性強(qiáng)：間接凝集反應(yīng)是最敏感型的血清學(xué)反應(yīng)方法之一，可以檢測到微量的抗體和抗原；快速：一般1h-2h即可判定結(jié)果，若在玻板上進(jìn)行，則只需幾分鐘；特異性強(qiáng)；使用方便、簡單三．載體具有吸附抗原（或抗體）的載體很多，如聚苯乙烯乳膠、白陶土、活性炭、人和多種動(dòng)物的紅血球、某些細(xì)菌等。良好的載體有以下幾點(diǎn)基本要求：在生理鹽水或緩沖液無自凝傾向；大小均勻；比重與介質(zhì)相似，短時(shí)間內(nèi)不能沉淀；無化學(xué)或血清學(xué)活性吸附抗原（或抗體）后，不影響其活性。目前應(yīng)用最廣的是人的O型紅血球和綿羊紅血球。而后者應(yīng)用更廣，因?yàn)槠鋪碓捶奖?。另外綿羊紅血球的表面有大量的（約1000個(gè)以上）糖蛋白受體，極易吸附某些抗原物質(zhì)，吸附性能好，且大小均勻一致?！緦?shí)驗(yàn)材料】材料土豆塊莖、韭菜葉片、家兔、抗人A血清、抗人B血清試劑（1）PBS緩沖液稱取 NaCl7.2g、Na2HPO41.48g、KH@PO$0.43g，加蒸餾水，定容至1L，調(diào)pH至7.2。（2）1%肝素溶液0.1g肝素溶解于10mL0.9%氯化鈉溶液中。器材5mL注射器、酒精棉球、雙凹片、載玻片、普通光學(xué)顯微鏡、托盤天平、滴管、離心管?！緦?shí)驗(yàn)步驟】取土豆去皮塊莖2支，加10mLPBS緩沖液，浸泡2小時(shí)，浸出的粗提液中即含有可溶性土豆凝集素。抽取兔子靜脈血（加抗凝劑）1mL，加生理鹽水3mL，在1000r/min條件下，離心5分鐘，重復(fù)3次離心。最后按壓積紅細(xì)胞體積用生理鹽水配成2%紅細(xì)胞懸液。用滴管吸取土豆凝集素和2%紅細(xì)胞懸液各一滴，置雙凹片的左孔內(nèi)，充分混勻，靜置10分鐘后，顯微鏡下觀察。同時(shí)以PBS緩沖液加2%紅細(xì)胞懸液各一滴，置雙凹片右孔作對(duì)照實(shí)驗(yàn)?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】實(shí)驗(yàn)前后的宏觀效果對(duì)比開始：PBS緩沖液土豆凝集素開始時(shí)，從宏觀上來看，加入PBS緩沖液和加入土豆凝集素的兩滴細(xì)胞懸液差異不大，此時(shí)還未發(fā)生細(xì)胞凝集作用。終了：沙粒狀物質(zhì)PBS緩沖液土豆凝集素結(jié)束時(shí)，對(duì)比已經(jīng)比較明顯，其中加入土豆凝集素的細(xì)胞懸液發(fā)生了細(xì)胞凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞凝集在一起，形成了沙粒狀的物質(zhì)，周圍的懸液較澄清。2．顯微鏡下微觀效果對(duì)比PBS溶液：細(xì)胞呈常態(tài)，無明顯變化。土豆凝集素：很多細(xì)胞凝集在一起，形成了若干塊的凝集后的產(chǎn)物，顏色較深?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果分析與注意事項(xiàng)】把液體滴加到雙凹片上時(shí)，注意用量，防止過多的懸液溢出后，使兩個(gè)細(xì)胞懸液接觸，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。用手晃動(dòng)雙凹片時(shí)，注意搖晃的姿勢：一只手用手掌處貼緊雙凹片，另一只手抵住雙凹片的另一側(cè)上下晃動(dòng)?！舅伎碱}】哪些因素影響細(xì)胞凝集反應(yīng)？答：溫度。溫度影響酶的活性。時(shí)間。隨著時(shí)間的延長細(xì)胞聚集程度增大。凝集素。不同的凝集素凝集程度不同。反應(yīng)底物。細(xì)胞類型。反應(yīng)培養(yǎng)板的質(zhì)量。人為因素。結(jié)合凝集素的特性，簡述凝集素在生物學(xué)中有何應(yīng)用？研究凝集素有何意義？答：人們利用凝集素與不同的糖蛋白特異性結(jié)合的原理，識(shí)別和研究不同類型膜結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特征，以及進(jìn)行血型鑒定。ABO血型鑒定主要用于臨床輸血，在皮膚、腎等器官移植的時(shí)候選擇ABO血型相符的供體；不孕癥和新生兒溶血癥病因的分析及親子鑒定等。另外，凝集素在臨床疾病防治、機(jī)體生理活動(dòng)