DB21-T 3257-2020豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測(cè)方法

ICS11.220

B41

備案號(hào)：71443-2020DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3257—2020

豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體

酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法

MethodofELISAforPRRSVantibodyNEQ

DB21/T3257—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（遼寧）提出，遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口管理。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。

本標(biāo)準(zhǔn)協(xié)助單位：洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司、遼寧佰瑞生物科技有限公司。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周晨陽、魏澍、高志峰、魏園園、王冰、董娜、劉金玲、劉耀川、楊作豐、高

原、王連山、馬亮亮、潘婷婷、楊嶸長、姜斌、楊太東、于春玲。

本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，

我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。

歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話

標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省動(dòng)物及產(chǎn)品檢疫中心（沈陽市沈河區(qū)萬柳塘路105號(hào)甲），聯(lián)系電

話

II

DB21/T3257—2020

豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于在生物安全Ⅱ級(jí)（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒病的診斷、

監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬血清或血漿樣品中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T19495.2-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3縮略語

下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

ELISA：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay）

PRRSV：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus）

PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）

OD：光密度，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度（opticaldensity）

4原理

本方法原理是包被板上包被的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗原，可與待測(cè)樣品中的特異

性抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記的二抗，則形成免疫復(fù)合物，洗滌后，如待測(cè)樣品

中含有PRRSV抗體，顯色深，為陽性，反之為陰性。

5儀器和器材

5.1微量可調(diào)移液器：50μL～200μL。

5.25mL采血針管

5.3冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱。

5.4酶標(biāo)儀

5.537℃恒溫培養(yǎng)箱

5.6高速臺(tái)式離心機(jī)（離心范圍0～20000r/min）

5.7洗板機(jī)

5.8離心管：4mL離心管、2mL離心管和1.5mL離心管。

1

DB21/T3257—2020

6試劑

注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實(shí)驗(yàn)使用的試劑等級(jí)均為分析純或生化試劑；所有試劑均用無

菌的容器分裝。

6.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原包被板。

6.2陽性對(duì)照：豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性豬血清。

6.3陰性對(duì)照：無豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體豬血清。

6.4酶標(biāo)復(fù)合物：過氧化物酶標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體。

6.5PBS：磷酸鹽緩沖液（0.01mol/LpH7.4）配制見第A.1章。

6.6洗滌液：配制見第A.2章。

6.7樣品稀釋液：配制見第A.3章。

6.8底物溶液：配制見第A.5章。

6.9終止液：配制見第A.6章。

7操作步驟

注：試驗(yàn)操作過程中涉及生物安全的注意事項(xiàng)依據(jù)GB19489《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》的規(guī)

定執(zhí)行。

7.1樣品的采集、前處理與存放

7.1.1采樣注意事項(xiàng)

采集樣品及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。

7.1.2采樣工具

5mL采血針管和4mL、2mL和1.5mL離心管經(jīng)121±1℃高壓滅菌20min。

7.1.3樣品的采集與前處理

采集血液，用離心機(jī)分離上清血清，血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無污染。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一

編號(hào)，并用樣品稀釋液作40倍稀釋。

7.1.4存放

前處理后的樣品密封裝于滅菌離心管內(nèi)，4℃或-20℃保存或立即檢驗(yàn)。

7.2ELISA檢測(cè)

7.2.1在使用前，所有的試劑盒組份應(yīng)恢復(fù)到18～26℃。試劑應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩混勻。

7.2.2取出包被板，加入100μL沒有稀釋的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，每次檢測(cè)各加兩孔；在相應(yīng)的孔中

加入100μL已經(jīng)稀釋好的樣品。

7.2.3在37℃條件下溫育30min（±1min）。

7.2.4將各孔的液體棄入廢液桶，用300μL洗滌液洗滌板孔，共洗滌5次。每次洗滌后應(yīng)棄去孔內(nèi)的

液體。在最后一次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液在吸水紙上拍干。

7.2.5每孔加入100μL酶結(jié)合物。

7.2.6在37℃條件下溫育20min（±1min）。

7.2.7重復(fù)步驟7.2.4。

7.2.8每孔加入50μL顯色液A和50μL顯色液B（也可顯色液A、B等比例混勻后加100μL）。

2

DB21/T3257—2020

7.2.9在37℃條件下溫育10min（±1min）。

7.2.10每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。測(cè)量并且記錄樣品和對(duì)照的OD值（450nm），15min

內(nèi)讀值有效。

8試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定

8.1試驗(yàn)成立條件

陰性對(duì)照平均值（NCX）NC=(NC1+NC2)/2

陽性對(duì)照平均值（PC）PC=(PC1+PC2)/2

試驗(yàn)成立判斷標(biāo)準(zhǔn)：PC-NC≥0.5；NC≤0.3。

如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，應(yīng)按照操作說明書重做一次試驗(yàn)。

8.2結(jié)果判定

樣品的計(jì)算S/P=(樣品－NC)/(PC－NC)

如果樣品S/P值＜0.2，樣品應(yīng)判定為抗體陰性。

如果樣品S/P值≥0.2，樣品應(yīng)判定為抗體陽性。

9檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施

按照GB/T19495.2-2004的規(guī)定執(zhí)行。

10廢棄物處理

按照《農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)〈病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范〉的通知》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號(hào))

規(guī)定執(zhí)行。

3

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附錄A

（資料性附錄）

試劑配制

A.1磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/LpH7.4）

氯化鈉8g

氯化鉀0.2g

磷酸二氫鉀0.2g

十二水磷酸氫二鈉2.83g

蒸餾水加至1000mL

A.2洗滌液

PBS1000mL

吐溫-200.5mL

A.3樣品稀釋液

含體積分?jǐn)?shù)為10%新生豬血清的洗滌液

A.4磷酸鹽-檸檬酸緩沖液（pH5.0）

檸檬酸3.26g

十二水磷酸氫二鈉12.9g

蒸餾水700mL

A.5底物溶液

用二甲基亞砜3ˊ3ˊ5ˊ5ˊ-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）配成1%質(zhì)量濃度，4℃保存。使用時(shí)按下列配方

配制底物溶液。

磷酸鹽-檸檬酸緩沖液9.9mL

1%3ˊ3ˊ5ˊ5ˊ-四甲基聯(lián)苯胺0.1mL

30%雙氧水1μL

A.6終止液

濃硫酸0.31mL

蒸餾水100mL

_________________________________

4

DB21/T3257—2020

目次

前言............................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3縮略語............................................................................1

4原理..............................................................................1

5儀器和器材........................................................................1

6試劑..............................................................................2

7操作步驟..........................................................................2

8試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定............................................................3

9檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施......................................................3

10廢棄物處理.......................................................................3

附錄A（資料性附錄）試劑配制........................................................4

I

DB21/T3257—2020

目次

前言............................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3縮略語