生技11發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方案

生技11、專升本13發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)一中草藥梔子活性成分京尼平苷轉(zhuǎn)化菌篩選（細(xì)菌）原理：利用京尼平苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后產(chǎn)生京尼平與谷氨酸反應(yīng)生成藍(lán)色。通過平板顏色變化來判斷是否存在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。材料與儀器：主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、250ml三角瓶、培養(yǎng)皿、移液管、移液槍、移液槍盒、藍(lán)蓋瓶、涂布棒、接種環(huán)（針）、1000ml燒杯、100ml燒杯、玻璃棒、離心管、高壓滅菌鍋、鑷子原料與藥品：梔子、谷氨酸、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉培養(yǎng)基：分離篩選培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基鑒定培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基+梔子+谷氨酸實(shí)驗(yàn)方法：β-葡萄糖苷酶的菌株篩選富集培養(yǎng)（初篩）（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：收集產(chǎn)酶菌株可能存在的樣品：中藥港采集新鮮土樣、梔子在土里培養(yǎng)發(fā)霉的土樣儀器滅菌：將培養(yǎng)皿、移液管、涂布棒、移液槍頭、蒸餾水等滅菌煮梔子浸提液：稱量已粉碎梔子，加適量水煮一個(gè)小時(shí)，紗布過濾收集濾液，重復(fù)煮三到四次煮，將幾次煮的濾液混合，濾液收集體積與梔子稱量的量為10:1。配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按培養(yǎng)基配方稱好，瓊脂，加熱溶化，分裝，121攝氏度高壓滅菌20min，倒平板。用梯度稀釋法來分離產(chǎn)生菌：取所采的土樣5g，加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，振蕩5min，制成土壤懸液，此時(shí)的稀釋度為10-1。另取7支試離心管，分別記作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8個(gè)梯度，每支離心管內(nèi)加入9mL無菌水。用無菌移液管從三角瓶中吸取1mL土壤懸液，加入到10-2離心管中混勻，再從此試管中吸取1mL加入到10-2離心管中，依此類推直至10-7離心管。分別從10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8七個(gè)稀釋度的離心管中吸取100uL懸液，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)。24h后觀察現(xiàn)象。復(fù)篩3.1.2.1、鑒定培養(yǎng)基復(fù)篩稱取谷氨酸（培養(yǎng)基的1%，在超凈工作臺(tái)滅菌20min）加入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中充分溶解，吸取梔子浸提液（培養(yǎng)基的10%）到培養(yǎng)基中搖勻，倒平板。將上述富集培養(yǎng)的菌種涂布或劃線或點(diǎn)種到鑒定培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后觀察變色圈。3.1.2.2、分離純化將有透明圈的菌株挑出分離純化實(shí)驗(yàn)二、菌種的保藏和活化一、目的和要求

1、了解各種保藏方法的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用的目標(biāo)微生物。

2、學(xué)習(xí)并掌握幾種常用的微生物菌種保藏方二、實(shí)驗(yàn)原理保藏微生物菌種的目的不僅要保存菌株的生命本身，而且還必須要盡可能地使菌株的遺傳性狀保持不變，同時(shí)保證其在整個(gè)保存過程中不被他種微生物污染。因此，選擇一種能夠長(zhǎng)期有效且穩(wěn)定的保藏微生物菌種的方法事關(guān)重要。使微生物的代謝作用降至最低程度，從而使其處于不活潑的狀態(tài)，即休眠狀態(tài)。就微生物本身而言，保藏就是要利用它們處于休眠狀態(tài)的孢子或芽孢而進(jìn)行；而從環(huán)境條件來說，就是要選用低溫、干燥和缺氧等三個(gè)條。三、實(shí)驗(yàn)材料純化好的目的菌種、40﹪甘油、EP管四、實(shí)驗(yàn)步驟1、甘油管制備：用量筒準(zhǔn)確量取40mL試劑級(jí)丙三醇，再加蒸餾水60mL，搖勻，即為40%甘油溶液。將配置好的甘油溶液放于25mL的三角瓶中塞好棉塞，用紗布，牛皮紙包扎好，再把1-5mL的凍存管用紗布牛皮紙包扎好，在0.1±0.05Mpa，120±2℃濕熱滅菌1-1.5小時(shí)，間歇滅菌3-5次，滅菌后置34±0.5℃恒溫室培養(yǎng)24-48小時(shí)，經(jīng)抽樣2、菌種保藏：取第三代純化的菌種平板，用無菌水將目的菌洗下，用移液槍將其移入帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩15min，將其傾入漏斗三角瓶上過濾，目的菌和40﹪甘油以1:1的比例放入EP管中，放入-20℃五、菌種復(fù)活從冰箱中取出EP管進(jìn)行解凍，解凍后在超凈工作臺(tái)中將保藏菌種接種于倒好培養(yǎng)基的平板中，首先每個(gè)EP管中取100ml菌液接種于平板中，每個(gè)管接一個(gè)平板，然后將接種好的平板于30℃實(shí)驗(yàn)三β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的誘變一、菌懸液的制備無菌狀態(tài)下，將10mL的0.9%無菌生理鹽水移入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面菌種中洗脫菌種，然后經(jīng)過4層紗布過濾取濾液，倒入預(yù)先滅菌的具有玻璃珠、磁力棒和90mL生理鹽水的錐形瓶中，于磁力攪拌器上攪拌10min，使菌種完全分散，制成不同菌濃度的菌懸濁液，備用。二、紫外誘變選育高產(chǎn)菌株采用功率為15W,照射距離為20cm,分別對(duì)相同濃度和體積的菌懸液進(jìn)行輻射處理,照射時(shí)間分別為40、80、120、160、200、240、280、320、360、400、440、480s,將處理過的菌懸液作梯度稀釋,涂布于平板培養(yǎng)基上,培養(yǎng)后計(jì)算致死率。以致死率在80%～90%的誘變劑量處理菌懸液,處理后涂布于篩選平板培養(yǎng)基（改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，含10%梔子液及谷氨酸）上培養(yǎng),根據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。致死率=(對(duì)照菌落數(shù)-處理菌落數(shù))/對(duì)照菌落數(shù)×100%。三、超聲波誘變選育高產(chǎn)菌株采用20kHz、200W的超聲波條件,分別對(duì)相同濃度和體積的菌懸液進(jìn)行輻射處理10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120s,將處理過的菌懸液作梯度稀釋,涂布于平板培養(yǎng)基上,培養(yǎng)后計(jì)算致死率。以致死率在80%～90%的誘變劑量處理菌懸液,處理后涂布于篩選平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),根據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。四、微波誘變選育高產(chǎn)菌株采用脈沖頻率為2450MHz，功率為800W的微波爐，分別對(duì)相同濃度和體積的單孢子懸液進(jìn)行輻射處理。每次照射30s后使平皿冷卻，再進(jìn)行照射，并將照射時(shí)間累計(jì)。設(shè)定不同的輻射時(shí)間為不同的微波處理劑量，相同條件非輻射菌懸液平板培養(yǎng)，計(jì)算致死率：致死率=（對(duì)照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)）/對(duì)照菌落數(shù)×100%根據(jù)致死率，以致死率超過90%的誘變劑量處理菌懸液，輻射后涂布涂布于篩選平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),根據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。注意：誘變的同時(shí)要做對(duì)照，即不照射紫外或其他射線，在同等條件下培養(yǎng)。紫外誘變要在沒有關(guān)照的情況下進(jìn)行，誘變后的培養(yǎng)也在黑暗的情況下培養(yǎng)（可用黑色塑料袋包好后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)）。實(shí)驗(yàn)四、發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆瘴⑸镄泵媾囵B(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基確定方法，學(xué)會(huì)對(duì)已確定菌種確定實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工藝。(一)培養(yǎng)基成分1、斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基2、種子培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基3、發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(二)實(shí)驗(yàn)方法1、菌種的復(fù)活：將菌種在無菌條件下接入斜面培養(yǎng)基中，30℃下恒溫培養(yǎng)24小時(shí)2、種子培養(yǎng)：將斜面菌株接種到種子培養(yǎng)基中,30℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)3液體發(fā)酵：將培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)基中的菌體按10%接種量接人到發(fā)酵培養(yǎng)基(250mL三角瓶裝25mL培養(yǎng)液,121℃滅菌20分鐘),30℃,搖床180轉(zhuǎn)／分,培小72時(shí),取出發(fā)酵液,4000rpm/min離心10分鐘,收集上清液5液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化不同碳源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：分別以麩皮，玉米粉，蔗糖，淀粉，麥芽糖為碳源，發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)酶活，選著最佳碳源，在以不同濃度優(yōu)化.不同氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：分別以硫酸銨，蛋白胨，酵母膏，硝酸鈉，尿素為氮源，發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)酶活，選著最佳氮源，再以不同濃度優(yōu)化.磷酸鹽對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0，0.1%、0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%的磷酸鉀進(jìn)行優(yōu)化發(fā)酵起始PH優(yōu)化;將起始PH分別調(diào)至4，5,6,7,8進(jìn)行發(fā)酵，選著最適PH值。正交試驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)化率條件.6發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵溫度的優(yōu)化：發(fā)酵溫度分別控制在26℃,28℃,30℃,32搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化;在最適溫度下，分別以140ｒ/miｎ,160ｒ/miｎ,180ｒ/miｎ,200ｒ/miｎ,220ｒ/miｎ下發(fā)酵培養(yǎng)，選著最佳轉(zhuǎn)速。接種量的優(yōu)化：接種量分別為5%，10%，15%，發(fā)酵培養(yǎng)，選著最佳接種量.培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化：分別培養(yǎng)3,4，5,6,7,8,9天，測(cè)轉(zhuǎn)化率，選著最佳發(fā)酵時(shí)間.裝液量的優(yōu)化：分別裝25ｍｌ,40ｍｌ,55ｍｌ,70ｍｌ,85ｍｌ,100ｍｌ培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，選擇最佳裝液.京尼平的測(cè)定方法一、試劑配制：精氨酸（0.2mg/ml）：稱取20毫克精氨酸溶解后定溶于100容量瓶，冰箱保存?zhèn)溆?。二、操作步驟;1、用無菌水沖洗斜面孢子，并用接種環(huán)不斷刮斜面以使孢子懸浮充分。將其接種到加有一定量梔子浸提液（如：終濃度2%、5%）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150r/min震蕩培養(yǎng)3d。同時(shí)以不接種的梔子浸提液發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，150r/min震蕩培養(yǎng)3d做為空白對(duì)照（注意：若做不同梔子量的培養(yǎng)基水平時(shí)，要記得有針對(duì)的空白對(duì)照。如2%和5%有各自對(duì)應(yīng)的空白對(duì)照。）。2、取出發(fā)酵液，40000rpm/min高速離心10分鐘，收集上清液即為京尼平樣品溶液。3、移取稀釋至適當(dāng)倍數(shù)的京尼平樣品液2.0