DNA測序技術(shù)的發(fā)展進程

DNA測序技術(shù)的發(fā)展進程一、本文概述本文旨在深入探討DNA測序技術(shù)的發(fā)展進程，從早期的Sanger測序法到現(xiàn)代的下一代測序（NextGenerationSequencing，NGS）技術(shù)，再到最新的單分子測序技術(shù)，概述這些技術(shù)的基本原理、發(fā)展歷程以及對生物學和醫(yī)學領(lǐng)域產(chǎn)生的深遠影響。我們將從技術(shù)的角度出發(fā)，分析這些測序方法如何提高測序速度、降低成本，以及提高測序數(shù)據(jù)的準確性和分辨率。我們還將探討這些技術(shù)的發(fā)展如何推動基因組學、疾病研究、藥物研發(fā)和個性化醫(yī)療等領(lǐng)域的發(fā)展。通過本文的闡述，讀者將能夠全面了解DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷程和現(xiàn)狀，以及未來可能的發(fā)展趨勢和挑戰(zhàn)。二、第一代DNA測序技術(shù)在20世紀70年代末至90年代初，隨著分子生物學和生物化學的飛速發(fā)展，人類迎來了第一代DNA測序技術(shù)——雙脫氧終止法，也被稱為桑格測序法（Sangersequencing）。這項技術(shù)由弗雷德里克·桑格（FrederickSanger）于1977年首次提出，并因此獲得了1980年的諾貝爾化學獎。雙脫氧終止法測序的基本原理是在DNA合成過程中，使用四種不同的雙脫氧核苷酸（ddNTP）代替正常的脫氧核苷酸（dNTP）。當DNA聚合酶遇到雙脫氧核苷酸時，由于其3'端缺少羥基，無法形成磷酸二酯鍵，因此DNA鏈的合成會在此處終止。通過對終止在不同位置的DNA片段進行電泳分析，可以確定待測DNA序列中各個堿基的位置和順序。第一代DNA測序技術(shù)以其高準確性、高靈敏度和相對低廉的成本，為基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學等領(lǐng)域的研究提供了強大的支持。然而，由于其測序速度較慢、通量較低，使得大規(guī)?；蚪M測序變得耗時且成本高昂，因此急需一種更高效、更快速的測序技術(shù)來滿足日益增長的研究需求。隨著科技的進步，第二代和第三代DNA測序技術(shù)應(yīng)運而生，它們在測序速度、通量和成本等方面都有了顯著的提升，為生命科學研究和醫(yī)學診斷等領(lǐng)域帶來了革命性的變革。然而，第一代DNA測序技術(shù)作為開創(chuàng)性的里程碑，其歷史地位仍不可撼動。三、第二代DNA測序技術(shù)在21世紀初，第二代DNA測序技術(shù)，也被稱為下一代測序（Next-GenerationSequencing，NGS）技術(shù)，開始嶄露頭角。這項技術(shù)革命性地降低了測序成本，提高了測序速度，使得大規(guī)模的基因組測序成為了可能。第二代測序技術(shù)的代表有Illumina的Solexa技術(shù)、ABI的SOLiD技術(shù)和454LifeSciences的焦磷酸測序技術(shù)等。Illumina的Solexa技術(shù)：Solexa技術(shù)是基于邊合成邊測序的原理，通過可逆性末端終止和橋式PCR擴增，實現(xiàn)了高通量的并行測序。這種技術(shù)具有測序速度快、準確性高、成本低等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于基因組重測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小RNA測序等多個領(lǐng)域。ABI的SOLiD技術(shù)：SOLiD技術(shù)采用四色熒光標記寡核苷酸進行連續(xù)的連接反應(yīng)，通過顏色編碼識別堿基序列。這種技術(shù)具有長讀長、高分辨率和高準確性的特點，適用于基因組結(jié)構(gòu)變異、甲基化等研究。454LifeSciences的焦磷酸測序技術(shù)：焦磷酸測序技術(shù)是基于焦磷酸測序反應(yīng)的原理，通過檢測焦磷酸釋放過程中的光信號來識別堿基序列。這種技術(shù)具有測序速度快、讀長長、無需PCR擴增等優(yōu)點，特別適用于宏基因組學、微生物組學等領(lǐng)域的研究。第二代DNA測序技術(shù)的出現(xiàn)，極大地推動了基因組學研究的進步。它不僅降低了測序成本，提高了測序效率，還使得大規(guī)模的基因組測序和重測序成為了可能。第二代測序技術(shù)也為轉(zhuǎn)錄組學、表觀遺傳學、微生物組學等多個領(lǐng)域的研究提供了強有力的工具。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，第二代DNA測序技術(shù)將在生命科學研究中發(fā)揮更加重要的作用。四、第三代DNA測序技術(shù)第三代DNA測序技術(shù)，又稱為下一代測序技術(shù)（NextGenerationSequencing，NGS），是在第二代測序技術(shù)的基礎(chǔ)上進一步發(fā)展而來的。與前兩代技術(shù)相比，第三代測序技術(shù)以其更高的通量、更低的成本和更高的準確性，正在引領(lǐng)DNA測序技術(shù)進入一個新的時代。第三代測序技術(shù)的核心在于單分子測序，它能夠在單個DNA分子上進行測序，從而消除了PCR擴增的需要，避免了由此產(chǎn)生的偏差和錯誤。這種技術(shù)通常使用納米孔或單分子熒光成像等方法，對DNA分子進行直接的測序。納米孔測序是一種代表性的第三代測序技術(shù)，它利用電場驅(qū)動DNA分子通過納米尺度的孔洞，同時監(jiān)測通過孔洞的離子電流變化，從而推斷出DNA序列信息。這種技術(shù)具有高通量、長讀長和低成本等優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)對基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組等復(fù)雜生物樣本的大規(guī)模測序和分析。單分子熒光成像測序則是另一種重要的第三代測序技術(shù)，它通過在單個DNA分子上標記熒光染料，然后利用高靈敏度的顯微鏡對熒光信號進行捕捉和解析，從而得到DNA序列信息。這種技術(shù)具有極高的準確性和靈敏度，能夠?qū)崿F(xiàn)對單個DNA分子的精確測序。隨著第三代測序技術(shù)的不斷發(fā)展，其在基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、表觀組學、微生物組學等領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。未來，隨著技術(shù)的進一步成熟和成本的降低，第三代測序技術(shù)有望在生物醫(yī)學、生物信息學、農(nóng)業(yè)科學等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，推動人類對生命科學的認識進入一個新的階段。五、未來展望DNA測序技術(shù)，作為現(xiàn)代生物學和醫(yī)學領(lǐng)域的重要支柱，自其誕生以來已經(jīng)取得了顯著的進步。然而，隨著科學技術(shù)的日新月異，這一領(lǐng)域仍充滿了無限的可能性和挑戰(zhàn)。展望未來，我們可以預(yù)見DNA測序技術(shù)將在多個方面實現(xiàn)突破性的進展。測序速度和準確性的進一步提高將是未來研究的重點。隨著新一代測序技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，我們可以期待更短的時間內(nèi)完成更復(fù)雜的基因組測序任務(wù)，同時保證結(jié)果的準確性。這將極大地推動基因組學研究的進步，使得科學家們能夠更深入地理解生命的奧秘。隨著大數(shù)據(jù)和人工智能技術(shù)的發(fā)展，DNA測序數(shù)據(jù)的處理和分析能力將得到極大的提升。通過構(gòu)建更高效的算法和模型，科學家們將能夠更快速地挖掘出基因組數(shù)據(jù)中的有用信息，從而加速生物醫(yī)學研究的進程。DNA測序技術(shù)在臨床應(yīng)用中的拓展也是未來的重要發(fā)展方向。例如，通過精準醫(yī)療和個性化治療的實現(xiàn)，DNA測序技術(shù)可以幫助醫(yī)生更準確地診斷疾病，并制定出更加有效的治療方案。同時，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，DNA測序技術(shù)也將在遺傳病治療和生物育種等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。然而，技術(shù)的發(fā)展也帶來了倫理和隱私等方面的挑戰(zhàn)。如何在保證科學進步的保護個人隱私和數(shù)據(jù)安全，將是未來需要面對的重要問題。因此，加強相關(guān)法規(guī)的制定和執(zhí)行，以及推動跨學科的合作與交流，將對于推動DNA測序技術(shù)的健康發(fā)展具有重要意義。DNA測序技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心之一，其未來的發(fā)展前景廣闊而充滿挑戰(zhàn)。通過不斷創(chuàng)新和合作，我們有信心在不久的將來實現(xiàn)更多的科學突破，為人類的健康和福祉做出更大的貢獻。六、結(jié)論隨著科技的飛速發(fā)展，DNA測序技術(shù)已經(jīng)從最初的Sanger測序法發(fā)展到如今的高通量測序技術(shù)，為生命科學研究和醫(yī)學診斷帶來了巨大的變革。本文詳細回顧了DNA測序技術(shù)的發(fā)展進程，從早期的雙脫氧測序法到新一代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，每一次技術(shù)的突破都極大地推動了我們對生命科學的理解和認知。在過去的幾十年里，DNA測序技術(shù)的進步不僅提高了測序的速度和準確性，還降低了成本，使得大規(guī)?；蚪M測序成為可能。這一發(fā)展進程不僅促進了基礎(chǔ)科學研究，還為臨床診斷和治療提供了強有力的支持。例如，通過全基因組測序，科學家們能夠更深入地了解疾病的發(fā)病機理，從而為疾病的治療和預(yù)防提供新的思路和方法。未來，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和完善，DNA測序技術(shù)將繼續(xù)在生命科學研究和醫(yī)學領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。我們期待著新一代測序技術(shù)在基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、表觀遺傳學等領(lǐng)域的應(yīng)用，為揭示生命奧秘和改善人類健康做出更大的貢獻。我們也需要注意到，隨著測序技術(shù)的普及和應(yīng)用范圍的擴大，數(shù)據(jù)的安全性和隱私保護等問題也日益凸顯，這需要我們不斷完善相關(guān)法規(guī)和規(guī)范，確保技術(shù)的健康發(fā)展。DNA測序技術(shù)的發(fā)展進程是一個充滿挑戰(zhàn)和機遇的歷程。它不僅推動了生命科學研究的進步，也為人類健康的改善提供了有力支持。我們有理由相信，在未來的日子里，DNA測序技術(shù)將繼續(xù)在生命科學領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為人類創(chuàng)造更加美好的未來。參考資料：DNA測序技術(shù)，也被稱為基因測序，是指通過生物化學方法，對DNA分子的堿基序列進行測定和解讀。自20世紀70年代初，DNA測序技術(shù)已經(jīng)經(jīng)歷了重大的發(fā)展，并持續(xù)地在生命科學、醫(yī)學、生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。20世紀70年代，美國科學家FrederickSanger和他的團隊發(fā)展出了第一代DNA測序技術(shù)——雙脫氧法。這種技術(shù)的核心是通過識別放射性標記的雙脫氧核苷酸，確定DNA序列中的特定位置。雖然雙脫氧法測序技術(shù)取得了重要的生物學發(fā)現(xiàn)，但其操作復(fù)雜，且需要大量的時間和人力。第二代DNA測序技術(shù)：聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）在20世紀90年代，隨著聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）的普及，第二代DNA測序技術(shù)得以快速發(fā)展。這些技術(shù)的出現(xiàn)使得DNA片段可以在體外進行大量復(fù)制，從而提高了測序的精度和效率。進入21世紀，隨著下一代測序（NGS）技術(shù)的出現(xiàn)，DNA測序進入了一個全新的階段。NGS技術(shù)采用了大規(guī)模并行測序的方法，可以在一次實驗中同時測定大量的DNA序列。這種技術(shù)大大縮短了測序時間，并顯著降低了成本。美國在DNA測序技術(shù)的發(fā)展上一直處于領(lǐng)先地位。從雙脫氧法到下一代測序（NGS），許多重要的技術(shù)和設(shè)備都是由美國的研究團隊開發(fā)的。同時，美國政府對生物技術(shù)的投入巨大，也極大地推動了DNA測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。盡管各個國家和地區(qū)都有自己的DNA測序技術(shù)和研究團隊，但是國際合作已經(jīng)成為一種趨勢。國際合作的加強，不僅有助于共享資源和技術(shù)，還可以促進標準的統(tǒng)一和提升。例如，國際人類基因組計劃就是一個成功的國際合作范例，它推動了人類基因組的全面解析。隨著DNA測序技術(shù)的不斷進步和應(yīng)用范圍的擴大，其在臨床診斷和治療上的應(yīng)用也日益顯著?；蚪M學和精準醫(yī)學的發(fā)展使得我們可以從基因?qū)用胬斫饧膊〉陌l(fā)生和發(fā)展，從而為患者提供更精確的治療方案。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷程展示了人類在生命科學領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和進步。從最初的放射性標記雙脫氧法到現(xiàn)在的下一代測序技術(shù)，我們已經(jīng)可以更深入地理解和應(yīng)用生命的本質(zhì)。而這種技術(shù)的進步不僅在基礎(chǔ)科學研究上發(fā)揮了重要作用，也在臨床醫(yī)學等領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠的影響。在全球范圍內(nèi)，越來越多的國家和團隊正在投入到這個領(lǐng)域的研究中，推動著DNA測序技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用。DNA測序（DNAsequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排列方式?？焖俚腄NA測序方法的出現(xiàn)極大地推動了生物學和醫(yī)學的研究和發(fā)現(xiàn)。在基礎(chǔ)生物學研究中，和在眾多的應(yīng)用領(lǐng)域，如診斷，生物技術(shù)，法醫(yī)生物學，生物系統(tǒng)學中，DNA序列知識已成為不可缺少的知識。具有現(xiàn)代的DNA測序技術(shù)的快速測序速度已經(jīng)有助于達到測序完整的DNA序列，或多種類型的基因組測序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整DNA序列。70年代末，WalterGilbert發(fā)明化學法、FrederickSanger發(fā)明雙脫氧終止法手動測序，同位素標記80年代中期，出現(xiàn)自動測序儀（應(yīng)用雙脫氧終止法原理）、熒光代替同位素，計算機圖象識別人類基因組計劃、基因芯片、個性化分子診斷、生物云計算……這些在21世紀第一個十年里吸引無數(shù)眼球的熱門詞匯，都和一個產(chǎn)業(yè)頗有淵源——DNA測序。生物技術(shù)和信息技術(shù)在這片創(chuàng)意新天地里水乳交融，如果用一句詩來形容坐擁兩大技術(shù)護航的DNA測序產(chǎn)業(yè)，那就是——天生麗質(zhì)難自棄。在業(yè)內(nèi)人士眼里，DNA測序出身高貴，它破解基因密碼(即堿基序列)，將基因組學與IT技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展出一門新興學科——生物信息學。以它為代表的基因技術(shù)，顛覆了傳統(tǒng)生物學技術(shù)，引領(lǐng)生命科學未來發(fā)展潮流。以它為代表的基因工程，在醫(yī)療健康、環(huán)境保護、新能源、新材料、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)等熱門領(lǐng)域大顯身手。在業(yè)外人士眼里，DNA測序足夠高科技，堪稱“一項新技術(shù)衍生出一個新行業(yè)”的典范，在短時間內(nèi)迅速成為國內(nèi)外VC和PE的寵兒，發(fā)展速度之快以至于沒有人能準確描繪出它十年后的發(fā)展藍圖。在日新月異的DNA測序技術(shù)面前，任何預(yù)測可能都顯得保守。高科技領(lǐng)域就是這樣一個誕生傳奇的地方。DNA測序已從一項令人高山仰止的前沿技術(shù)迅速普及為生命科學常規(guī)技術(shù)。DNA測序成本下降的速度幾乎可與電腦芯片運算能力增強的速度匹敵。DNA測序的發(fā)展不僅體現(xiàn)在成本的降低，更表現(xiàn)在高通量測序使得工作效率得到了大幅提高，這就為DNA測序產(chǎn)業(yè)化鋪平了道路。在DNA測序商業(yè)化的浪潮下，我國《生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》提出完成10000種微生物、100種動植物基因組測序、發(fā)現(xiàn)約500個新的功能基因、轉(zhuǎn)化應(yīng)用5個以上有重大經(jīng)濟價值的基因或蛋白。按照每種微生物進行“基因組完成圖”測序的費用為30-50萬元來看，DNA測序帶來的市場容量達千億元，這還僅僅是DNA測序商業(yè)應(yīng)用市場的冰山一角。化學試劑處理末段DNA片段，造成堿基的特異性切割，產(chǎn)生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳分離。化學切割反應(yīng)：包括堿基的修飾，修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去在失去堿基的糖環(huán)處DNA斷裂。就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等，因此上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。高通量測序技術(shù)（High-throughputsequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next-generation"sequencingtechnology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模并行簽名測序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS）、聚合酶克?。≒olonySequencing）、454焦磷酸測序（454pyrosequencing）、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、離子半導(dǎo)體測序（Ionsemiconductorsequencing）、DNA納米球測序（DNAnanoballsequencing）等。由LynxTherapeutics公司在90年代發(fā)展的MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS技術(shù)是“下一代”測序技術(shù)發(fā)展的先驅(qū)。MPSS是一種基于磁珠（bead）和接頭（adaptor）連接和解碼的復(fù)雜技術(shù)，測定結(jié)果短，多用于轉(zhuǎn)錄組測序，測定基因表達量。MPSS測定結(jié)果有序列偏好性而易丟失DNA中某些特定序列，且操作復(fù)雜，已逐漸淡出，被新的方法替代。2005年哈佛GeorgeChurch實驗室發(fā)展起來的，基于乳化PCR(emulsionPCR)和自動顯微鏡等技術(shù)的測序方法。相關(guān)技術(shù)已整合進ABI公司的SOLiD測序技術(shù)平臺。由454公司發(fā)展的并行焦磷酸測序方法。該方法在油溶液包裹的水滴中擴增DNA（即emulsionPCR）,每一個水滴中開始時僅包含一個包被大量引物的磁珠和一個鏈接到微珠上的DNA模板分子（控制DNA濃度出現(xiàn)的大概率事件）。將emlusionPCR產(chǎn)物加載到特制的PTP板上，板上有上百萬個孔，每個微孔只能容納一個磁珠。DNAPolymerase在將一個dNTP聚合到模板上的時候，釋放出一個PPi（焦磷酸分子）；在ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶）催化下，PPi與APS生成一個ATP分子；ATP分子在Luciferase（熒光素酶）的作用下，將luciferin（熒光素）氧化成oxyluciferin，同時產(chǎn)生的可見光被CCD光學系統(tǒng)捕獲，獲得一個特異的檢測信號，信號強度與相應(yīng)的堿基數(shù)目成正比。通過按順序分別并循環(huán)添加四種dNTP，讀取信號強度和發(fā)生時間，實現(xiàn)DNA序列測定。這一技術(shù)的讀長和每一堿基耗費都介于Sanger法測序和Solexa和SOLiD方法之間。454公司現(xiàn)下屬于Roche公司。Solexa公司開發(fā)了一種可反轉(zhuǎn)的染料終止法。DNA模板首先連接到與固體介質(zhì)（如玻璃板）交聯(lián)的引物上，并擴增形成本地微克隆。四種ddNTPs依次添加到體系中，未結(jié)合的ddNTPs在添加下一種核苷酸前被沖洗走。與454的焦磷酸測序不同，這種方法一次只延伸一個堿基?；蚍治鰞x(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP6)和GeneScan膠(POP4)。這些凝膠顆?？讖骄?，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。BigDye測序反應(yīng)試劑盒主要試劑是BigDyeMix，內(nèi)含PE專利四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反應(yīng)緩沖液等。pGEM-3Zf(+)雙鏈DNA對照模板2g/L，試劑盒配套試劑。M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，2μmol/L，即2pmol/μl，試劑盒配套試劑。DNA測序模板可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時取量1μl為宜。本實驗測定的質(zhì)粒DNA，濃度為2g/L，即200ng/μl。引物需根據(jù)所要測定的DNA片段設(shè)計正向或反向引物，配制成2μmol/L，即2pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。3mol/L醋酸鈉(pH2)稱取8gNaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。NaAc/乙醇混合液取5ml無水乙醇和5ml3mol/LNaAc混勻，室溫可保存1年。取2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃10s，50℃5s，60℃4min，25個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃離心30min，小心棄上清。加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。在PCR儀上進行熱變性(95℃2min)，冰中驟冷，待上機。按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細管，2kV預(yù)電泳5min，按編程次序自動進樣，再預(yù)電泳(2kV，20min)，在5kV下電泳2h。儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。測序反應(yīng)精確度計算公式：100%－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650×100%。差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。SILVERSEQUENCETMDNA測序系統(tǒng)是一種無放射性的序列分析系統(tǒng)，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結(jié)果可以在同一天內(nèi)得到；電泳完成后經(jīng)90分鐘就可讀序，這是常規(guī)的放射性測序法做不到的。SILVERSEQUENCETM系統(tǒng)用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統(tǒng)不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發(fā)光技術(shù)的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數(shù)熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。TaqDNA聚合酶在95℃時極強的熱穩(wěn)定性。本系統(tǒng)利用的測序級TaqDNA聚合酶是一種TaqDNA聚合酶的修飾產(chǎn)品，對于雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的準確性，能產(chǎn)生均一的條帶，且背景低。SILVERSEQUENCETM系統(tǒng)包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deazadGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC豐富區(qū)域所引起的條帶壓縮現(xiàn)象。退火溫度是熱循環(huán)測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結(jié)構(gòu)。提高引物結(jié)合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結(jié)構(gòu)則限制了小片斷PCR產(chǎn)物（<500bp）得到清楚的序列數(shù)據(jù)的能力。引物延伸起始于每個循環(huán)的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域，它可導(dǎo)致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應(yīng)該使用盡可能高的退火溫度。對于有牢固二級結(jié)構(gòu)的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環(huán)模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結(jié)果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結(jié)果。由于本系統(tǒng)采用熱循環(huán)裝置,與常規(guī)的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物使銀染技術(shù)能夠檢測序列條帶，測序反應(yīng)需要03～2pmol模板DNA，隨模板種類而定。(2).在每一個變性循環(huán)中的高溫可以取代對雙鏈DNA（dsDNA）模板的堿變性及乙醇沉淀過程，變性循環(huán)也有助于消除由于線性dsDNA模板（如PCR反應(yīng)產(chǎn)物）快速重退火所引起的問題。(3).高溫聚合酶反應(yīng)減弱了DNA模板的二級結(jié)構(gòu)，允許聚合酶穿過高度二級結(jié)構(gòu)化的區(qū)域。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲備液（38%丙烯酰胺W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺W/V）：95g丙烯酰胺，5g甲叉雙丙烯酰胺溶于140ml雙蒸水中，定容至250ml，45mm過濾器過濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。10%過硫酸銨，5g過硫酸銨溶于4ml水中，定容至5ml，應(yīng)新配新用。10×TBE緩沖液（1mol/LTris，83mol/L硼酸，10mmol/LEDTA）：1gTris，35g硼酸，72gNa2EDTA·2H2O，溶于雙蒸水中定容至1升，置于4℃下可貯存2周，其pH約為3。顯影溶液：60g碳酸鈉（Na2CO3）溶于2升超純水中，使用前加3ml37%甲醛和40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml）。對于每組測序反應(yīng)，標記四個5mleppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2ml適當?shù)膁/ddNTP混合物（d/ddNTPMix）。各加入1滴（約20μl）礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃?zhèn)溆?。對于每組四個測序反應(yīng)，在一個eppendorf管中混合以下試劑：在引物/模板混合物（以上第2步）中加入0ml測序級TaqDNA聚合酶（5μ/ml）。用吸液器吸動幾次混勻。從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內(nèi)。在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。把反應(yīng)管放入預(yù)熱至95℃的熱循環(huán)儀，以【注意】中循環(huán)模式為基準，開始循環(huán)程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。熱循環(huán)程序完成后，在每個小管內(nèi)加入3μlDNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉(zhuǎn)，終止反應(yīng)。3000～5000bp（超螺旋質(zhì)粒DNA）：4mg（2pmol）48000bp（λ,粘粒DNA）：1mg（31fmol）由于超螺旋質(zhì)粒產(chǎn)生的信號比松弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質(zhì)粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。dsDNA：1pmol=（6×10mg）×n，其中n為模板堿基對數(shù)ssDNA：1pmol=（3×10mg）×n，其中n為模板堿基數(shù)（3）為阻止TaqDNA聚合酶延伸非特異性退火引物，熱循環(huán)儀必須預(yù)熱至95℃。溫度變換應(yīng)越快越好。下面的循環(huán)時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。95℃2分鐘，然后：95℃30秒（變性），42℃30秒（退火），70℃1分鐘（延伸）。95℃2分鐘，然后：95℃30秒（變性），70℃30秒（退火/延伸）。銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導(dǎo)致凝膠染色時背景偏高（棕色）。短玻璃板經(jīng)粘合溶液處理可將凝膠化學交聯(lián)于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關(guān)重要。①在1ml95%乙醇，5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷（BindSilane），配成新鮮的粘合溶液。②用經(jīng)浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經(jīng)自然干燥的玻璃板，整個板面都必須擦拭。③4～5分鐘后，用95%乙醇單向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次這一清洗過程，每次均須換用干凈的紙，除去多余的粘合溶液。①在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷，使凝膠不能很好地粘附。③防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的，否則將導(dǎo)致凝膠撕裂。②5～10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。①用過的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗?；蛘吣z用10%NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開，如果出現(xiàn)交叉污染，以后制備的凝膠可能撕裂或變得松弛。（1）玻璃板經(jīng)粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用2mm或4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側(cè)，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側(cè)插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。（2）根據(jù)所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%～8%的膠濃度可獲得較好的結(jié)果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調(diào)終體積至2ml，并用45mm的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應(yīng)等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制后4～6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應(yīng)使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。（3）膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。①使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象。（1）當凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產(chǎn)生的氣泡，接上電源準備預(yù)電泳。（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應(yīng)先將水浴加熱至55℃后進行預(yù)電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產(chǎn)生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產(chǎn)的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。（5）按30V/cm的電壓預(yù)電泳20～30分鐘。預(yù)電泳的過程是去除凝膠的雜質(zhì)離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區(qū)形成的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，影響測序的結(jié)果。①用鯊魚齒梳制作加樣孔時，應(yīng)注意將齒尖插入膠中5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結(jié)果。②應(yīng)時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。當在預(yù)電泳時，即可進行樣品的制備，將反應(yīng)完畢的樣品在沸水浴中加熱1～3分鐘，立即置于冰上即可。如果樣品長時間不用，則應(yīng)重新處理。可使用4～6%聚丙烯酰胺凝膠，膠厚4mm。厚度小于4mm的膠可能導(dǎo)致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。關(guān)閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預(yù)電泳時擴散出來的尿素，然后立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢后，立即電泳。開始可用30V/cm進行電泳，5分鐘后可提高至40～60V/cm，并保持恒壓狀態(tài)。一般來說，一個55cm長，2mm厚的凝膠板，在2500V恒壓狀態(tài)下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩(wěn)定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可采用兩輪或多輪上樣。①上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應(yīng)等溫度達到后才能上樣電泳。②一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的分辨率降低，并且使帶擴散。電泳中可進行恒功率電泳。染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質(zhì)量的水洗滌盤子。電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應(yīng)該牢固地附著在短玻璃板上。固定凝膠：將凝膠（連玻璃板）放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒，充分振蕩20分鐘或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜（不振蕩）。保留固定/停止溶液，用于終止顯影反應(yīng)。洗膠：用超純水振蕩洗膠3次，每次2分鐘。從水中取出，當轉(zhuǎn)移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10～20秒，使水流盡。（1）在顯影溶液中加入甲醛（3ml）和硫代硫酸鈉溶液（400μl）以完成顯影液的配制。（2）從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5～10秒。注意，把凝膠從超純水轉(zhuǎn)移到顯影溶液的總時間不能長于5～10秒。浸泡時間過長則導(dǎo)致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長，可重復(fù)第五步用染色液浸泡。（3）立刻將凝膠轉(zhuǎn)移至1升（總量的一半）預(yù)冷的顯影液充分振蕩直至模板帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)第一批條帶，把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續(xù)顯影2～3分鐘或直至所有條帶出現(xiàn)。固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應(yīng)，固定凝膠。在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鐘，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景（如紙）上觀察凝膠，若需永久保存的記錄,則可用EDF膠片保留實驗結(jié)果。測序產(chǎn)物的銀染是顯現(xiàn)序列信息的一種新方法，本系統(tǒng)的成敗受幾個因素的影響①水的質(zhì)量對于染色的成功極其重要。超純水（NANOpureR或Milli-QR的水）或雙蒸水可獲得較好的效果，如果水中有雜質(zhì)，則低分子量條帶可能無法出現(xiàn)。②碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和KodakACS試劑級碳酸鈉（FisherCat#S263-500或S262-3，或KodakCat#109-1990），一般可獲得較好的結(jié)果。③色后的洗滌步驟是非常關(guān)鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA，產(chǎn)生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。④如果凝膠厚度超過4mm或丙烯酰胺濃度高于4～6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比4mm薄，染色反應(yīng)后的洗滌必須縮短至不超過5秒。⑤在室溫下進行所有步驟，顯影反應(yīng)除外。顯影溶液必須預(yù)冷至10～12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復(fù)使用任何溶液。使用EDF膠片可增強測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉(zhuǎn)移至EDF膠片之后可增強條帶可讀性。在暗室內(nèi)，將染色過的粘于玻璃板的凝膠（膠面向上）置于熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間，用一小條EDF膠片曝光不同時間，檢查不同的曝光強度，一般曝光20～40秒可得較好結(jié)果。在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角，然后把膠片置于凝膠上，使缺口位于左上角。由于EDF膠片是單面的，因此必須確保缺口在左上角。用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程：①進行EDF膠片顯影之前凝膠必須完全干燥。戴手套進行操作，以免印上指紋。同時注意EDF膠片不能用自動膠片處理器。②對于不同的光源最佳曝光時間可能不同，通過對一小條EDF膠片曝光不同時間以選擇你所用光源的最佳曝光時間，參閱膠片說明書。③曝光時間短則EDF膠片影像較深，曝光時間長則有助于減弱背景?！傍B槍法”是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超聲波等)或酶化學方法(如限制性內(nèi)切核酸酶)將生物細胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當?shù)妮d體結(jié)合，將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌擴增，獲得無性繁殖