細胞凋亡與骨關節(jié)炎

細胞凋亡與骨關節(jié)炎一、本文概述骨關節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是一種慢性的關節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨的退行性變和關節(jié)周圍組織的炎癥。隨著全球人口老齡化趨勢的加劇，骨關節(jié)炎的發(fā)病率逐年上升，嚴重影響了患者的生活質量。細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是一種由基因控制的細胞主動死亡過程，對于維持機體內部環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。近年來，越來越多的研究表明，細胞凋亡與骨關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關。本文旨在深入探討細胞凋亡在骨關節(jié)炎中的作用機制，以及如何通過調控細胞凋亡來預防和治療骨關節(jié)炎，為骨關節(jié)炎的臨床治療提供新的思路和方法。二、細胞凋亡概述細胞凋亡，又稱為程序性細胞死亡，是一種由基因控制的細胞自主有序的死亡方式。它與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用；它也不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡對于多細胞生物完成正常發(fā)育，維持內環(huán)境相對穩(wěn)定，以及抵御各種外界因素的干擾都起著非常關鍵的作用。在生物體的進化、內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中，細胞凋亡具有十分重要的生物學意義。在骨關節(jié)炎（OA）的病理過程中，細胞凋亡也扮演了重要的角色。關節(jié)軟骨細胞的凋亡被認為是骨關節(jié)炎發(fā)病機制中的一個關鍵環(huán)節(jié)。當關節(jié)受到損傷或老化時，軟骨細胞可能會發(fā)生凋亡，導致軟骨組織的破壞和關節(jié)功能的喪失。因此，深入研究細胞凋亡在骨關節(jié)炎中的具體作用機制，對于開發(fā)新的骨關節(jié)炎治療方法具有重要的指導意義。細胞凋亡的過程復雜且精細，涉及多種信號通路的交互作用。其中，死亡受體通路、線粒體通路和內質網通路是三條主要的凋亡信號通路。這些通路在接收到凋亡信號后，會觸發(fā)一系列的級聯(lián)反應，最終導致細胞的死亡。在骨關節(jié)炎中，這些凋亡通路可能會因為各種原因被激活，從而導致軟骨細胞的凋亡。細胞凋亡是一種重要的生物學現(xiàn)象，它在骨關節(jié)炎的發(fā)病過程中起著關鍵的作用。深入研究細胞凋亡的機制，將有助于我們更好地理解骨關節(jié)炎的發(fā)病機制，為開發(fā)新的治療方法提供理論依據。三、骨關節(jié)炎中的細胞凋亡骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種慢性的關節(jié)疾病，其特征是關節(jié)軟骨的退化、骨贅形成以及關節(jié)周圍組織的炎癥。在OA的發(fā)生和發(fā)展過程中，細胞凋亡扮演了重要的角色。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，它在維持組織穩(wěn)態(tài)、調控細胞數(shù)量和防止疾病發(fā)展等方面發(fā)揮著關鍵作用。在OA中，軟骨細胞的凋亡是導致關節(jié)軟骨退化的重要機制之一。多種因素，如年齡、肥胖、關節(jié)損傷、代謝異常等，都可能導致軟骨細胞凋亡的增加。隨著年齡的增長，軟骨細胞的凋亡率逐漸上升，導致軟骨基質的合成與分解平衡被打破，軟骨逐漸變薄、粗糙，最終發(fā)生退化。肥胖和關節(jié)損傷可通過增加關節(jié)內壓力、引發(fā)炎癥反應等方式，促進軟骨細胞凋亡。代謝異常，如高血糖、高血脂等，也可能通過影響細胞內信號通路或增加氧化應激等方式，誘導軟骨細胞凋亡。除了軟骨細胞外，OA中的滑膜細胞、骨細胞等其他關節(jié)組織細胞也可能發(fā)生凋亡。滑膜細胞的凋亡可能導致滑膜炎癥的減輕，但過度的凋亡也可能影響關節(jié)液的分泌和關節(jié)潤滑，加劇關節(jié)磨損。骨細胞的凋亡則可能影響骨代謝平衡，導致骨贅形成和骨質疏松等病理改變。因此，深入探討骨關節(jié)炎中細胞凋亡的機制，對于揭示OA的發(fā)病機理、尋找新的治療靶點具有重要意義。未來的研究應關注如何通過調控細胞凋亡來減緩OA的進程，為OA的防治提供新的思路和方法。四、細胞凋亡與骨關節(jié)炎治療的關聯(lián)細胞凋亡作為細胞生命周期中的一個重要環(huán)節(jié)，其異常與骨關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關。因此，深入探討細胞凋亡與骨關節(jié)炎治療的關聯(lián)，對于開發(fā)新的骨關節(jié)炎治療方法具有重要的理論意義和實踐價值。細胞凋亡異常導致的關節(jié)軟骨細胞死亡和基質降解是骨關節(jié)炎病理過程中的關鍵環(huán)節(jié)。針對這一過程，通過調控細胞凋亡通路，可以有望逆轉或延緩骨關節(jié)炎的進展。例如，通過抑制凋亡誘導因子或凋亡相關基因的表達，可以減少關節(jié)軟骨細胞的凋亡，從而維護關節(jié)軟骨的完整性和功能。目前，針對細胞凋亡的骨關節(jié)炎治療方法主要包括藥物治療和基因治療。藥物治療中，一些具有抗凋亡作用的藥物如抗氧化劑、生長因子等，已被證實可以在一定程度上緩解骨關節(jié)炎的癥狀，促進關節(jié)軟骨的修復。然而，藥物治療的效果往往有限，且存在副作用和耐藥性等問題?；蛑委焺t是一種更具潛力的治療方法。通過基因工程技術，可以針對特定的凋亡相關基因進行干預，從而實現(xiàn)對細胞凋亡的精確調控。例如，通過基因轉導技術，將抗凋亡基因導入關節(jié)軟骨細胞，可以增強其抗凋亡能力，促進關節(jié)軟骨的再生和修復。除了藥物治療和基因治療外，一些物理治療和手術治療方法也可以通過影響細胞凋亡過程來改善骨關節(jié)炎的預后。例如，物理治療如超聲波、電刺激等可以通過促進關節(jié)軟骨細胞的代謝和增殖，抑制其凋亡過程；而手術治療如關節(jié)置換等則可以通過移除病變的關節(jié)組織，為新的關節(jié)軟骨細胞的生長提供環(huán)境。細胞凋亡與骨關節(jié)炎治療之間存在著密切的關聯(lián)。通過深入研究細胞凋亡在骨關節(jié)炎中的作用機制，并探索基于細胞凋亡調控的治療方法，有望為骨關節(jié)炎的治療提供新的思路和手段。五、結論細胞凋亡是一種有序的、受基因調控的細胞死亡過程，它在骨關節(jié)炎的發(fā)病機制中扮演了重要角色。通過深入研究和理解細胞凋亡在骨關節(jié)炎中的具體作用，我們可以為預防和治療這一常見疾病提供新的策略。細胞凋亡的失調可能導致關節(jié)軟骨細胞的過度死亡，從而加速骨關節(jié)炎的進程。在骨關節(jié)炎的病變過程中，細胞凋亡的調控因子如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等起著關鍵作用。這些因子的表達變化不僅影響了關節(jié)軟骨細胞的生存和死亡，還進一步影響了關節(jié)軟骨的代謝和修復。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，一些外部因素如炎癥、機械壓力等也能通過影響細胞凋亡的過程，從而參與到骨關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中。這些發(fā)現(xiàn)為我們理解骨關節(jié)炎的發(fā)病機制提供了新的視角。細胞凋亡在骨關節(jié)炎的進程中起著重要作用，通過調控細胞凋亡的過程，我們有可能找到新的骨關節(jié)炎治療策略。未來的研究需要進一步深入探索細胞凋亡在骨關節(jié)炎中的具體作用機制，以期找到更有效的預防和治療方法。參考資料：凋亡素，一種在細胞凋亡過程中起到關鍵作用的蛋白質，近年來已成為生物學和醫(yī)學領域研究的熱點。特別是其在腫瘤細胞凋亡中的作用，更是引發(fā)了大量研究者的關注。本文將重點探討凋亡素與腫瘤細胞凋亡的研究進展。凋亡素是一種在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白質，它參與了細胞凋亡的多個環(huán)節(jié)。在正常情況下，細胞凋亡是一種自然的程序性死亡過程，對于維持機體內環(huán)境穩(wěn)定和組織發(fā)育至關重要。然而，在腫瘤細胞中，凋亡素的表達和功能往往受到異常調控，導致腫瘤細胞的無限增殖和逃避凋亡。凋亡素在腫瘤細胞中的表達水平與其增殖和凋亡狀態(tài)密切相關。研究表明，多種因素可以影響凋亡素的表達，如基因突變、表觀遺傳學改變、信號轉導通路異常等。深入探討這些因素如何調控凋亡素的表達，對于理解腫瘤發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。腫瘤細胞中存在著復雜的信號轉導網絡，這些網絡在凋亡素的表達和功能中起著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，凋亡素可以與多種信號轉導分子相互作用，通過影響這些分子的活性來調控腫瘤細胞的增殖和凋亡。因此，深入研究凋亡素與腫瘤細胞信號轉導的關系，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。由于凋亡素在腫瘤細胞凋亡中的關鍵作用，它已成為腫瘤治療領域的研究熱點。目前，一些研究已發(fā)現(xiàn)通過調控凋亡素的表達或活性，可以誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤的生長和擴散。還有一些研究試圖將凋亡素與其他抗腫瘤療法相結合，以提高治療效果。凋亡素與腫瘤細胞凋亡的研究是一個充滿挑戰(zhàn)和機遇的領域。雖然目前我們已經取得了一些重要的研究成果，但仍有許多問題需要進一步探討。例如，我們仍需深入了解凋亡素在腫瘤細胞中的具體作用機制，以及其在不同類型腫瘤中的表達和功能差異。如何有效調控凋亡素的表達或活性，以便將其應用于臨床腫瘤治療，也是當前研究的重點和難點。隨著科學技術的發(fā)展和研究的深入，我們相信凋亡素將在未來為腫瘤治療提供更多新的思路和方法。我們也期待研究者們在凋亡素與腫瘤細胞凋亡的研究中取得更多突破性的成果，為人類戰(zhàn)勝癌癥做出更大的貢獻。本研究旨在探討單味中藥骨碎補對兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡的作用。實驗通過建立兔膝骨關節(jié)炎模型，采用骨碎補進行干預，觀察軟骨細胞凋亡情況。結果表明，骨碎補可以顯著降低軟骨細胞凋亡率，對兔膝骨關節(jié)炎具有一定的治療作用。骨關節(jié)炎是一種常見的慢性關節(jié)疾病，其特征是關節(jié)軟骨的退行性改變和細胞凋亡增加。目前，骨關節(jié)炎的藥物治療主要集中在非甾體消炎藥和關節(jié)軟骨保護劑上，但治療效果有限。因此，尋找有效的藥物治療方案成為研究重點。單味中藥骨碎補具有補腎強骨、活血止痛的功效，被廣泛應用于治療骨折、骨關節(jié)炎等疾病。本研究通過實驗研究，探討骨碎補對兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡的作用。選取30只健康成年家兔，等量隨機分為兩組：對照組給予生理鹽水，定時記錄關節(jié)腫脹程度；實驗組給予骨碎補灌胃。采用無菌操作技術，在無菌條件下切除家兔膝關節(jié)內側副韌帶、前后交叉韌帶及部分內側關節(jié)囊，造成膝關節(jié)不穩(wěn)定，誘發(fā)骨關節(jié)炎。實驗組家兔給予骨碎補灌胃，給藥劑量為10g/kg，每天1次，連續(xù)給藥4周。采用HE染色觀察關節(jié)軟骨細胞形態(tài)變化；采用TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡情況；采用Westernblot法檢測Bcl-Bax、Caspase-3等凋亡相關蛋白的表達。采用SPSS0軟件進行數(shù)據分析，數(shù)據以均數(shù)±標準差表示。采用t檢驗，P<05為差異有統(tǒng)計學意義。HE染色結果顯示，對照組關節(jié)軟骨細胞排列紊亂，細胞數(shù)目減少，細胞外基質變性；實驗組關節(jié)軟骨細胞形態(tài)相對完整，排列較為整齊，細胞外基質較為豐富。TUNEL法檢測結果顯示，對照組軟骨細胞凋亡率明顯高于實驗組（P<05）。Westernblot法檢測結果顯示，實驗組Bcl-2表達水平高于對照組，Bax、Caspase-3表達水平低于對照組（P<05）。本研究結果表明，單味中藥骨碎補對兔膝骨關節(jié)炎具有一定的治療作用，其作用機制可能與抑制軟骨細胞凋亡有關。具體來說，骨碎補可能通過調節(jié)Bcl-Bax、Caspase-3等凋亡相關蛋白的表達，抑制軟骨細胞的凋亡過程。這為骨碎補在骨關節(jié)炎治療中的臨床應用提供了實驗依據。細胞凋亡（apoptosis）指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。人體內的細胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，有關細胞死亡過程的研究，已成為生物學、醫(yī)學研究的一個熱點。人們已經知道細胞的死亡起碼有兩種方式，即細胞壞死與細胞凋亡（apoptosis）。細胞壞死是早已被認識到的一種細胞死亡方式，而細胞凋亡則是逐漸被認識的一種細胞死亡方式。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。它在生物體的進化、內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細胞凋亡不僅是一種特殊的細胞死亡類型，而且具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制。凋亡是多基因嚴格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P35等，隨著分子生物學技術的發(fā)展對多種細胞凋亡的過程有了相當?shù)恼J識，但是迄今為止凋亡過程確切機制尚不完全清楚。而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。人的部分生理結構屬于自然凋亡，如人的有尾階段，尾部在發(fā)育過程中自動凋亡。1．凋亡概念的形成1965年澳大利亞科學家發(fā)現(xiàn)，結扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實質組織中有一些散在的死亡細胞，這些細胞的溶酶體并未被破壞，顯然不同于細胞壞死。這些細胞體積收縮、染色質凝集，從其周圍的組織中脫落并被吞噬，機體無炎癥反應。1972年Kerr等三位科學家首次提出了細胞凋亡的概念，宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始，在此之前，關于胚胎發(fā)育生物學、免疫系統(tǒng)的研究，肝細胞死亡的研究都為這一概念的提出奠定了基礎。2)染色體DNA的降解：細胞凋亡的一個顯著特征就是細胞染色質的DNA降解，凋亡時DNA的斷片大小規(guī)律是200bp的整數(shù)倍。4)鈣離子變化，細胞內鈣離子濃度的升高是細胞發(fā)生凋亡的一個重要條件。4．細胞凋亡的臨床應用基礎研究階段細胞凋亡的研究，其生命力在于最終能夠有利于疾病機制的闡明，以及新療法的探索及問世。其實從嚴格的詞學意義上來說，細胞程序性死亡（PCD）與細胞凋亡是有很大區(qū)別的。細胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是個功能性概念，描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。例如蝌蚪變成青蛙，其變態(tài)過程中尾部的消失伴隨大量細胞死亡，高等哺乳類動物指間蹼的消失、顎融合、視網膜發(fā)育以及免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育都必須有細胞死亡的參與。這些形形色色的在機體發(fā)育過程中出現(xiàn)的細胞死亡有一個共同特征：即散在的、逐個地從正常組織中死亡和消失，機體無炎癥反應，而且對整個機體的發(fā)育是有利和必須的。因此認為動物發(fā)育過程中存在的細胞程序性死亡是一個發(fā)育學概念，而細胞凋亡則是一個形態(tài)學的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學特征的與壞死完全不同的細胞死亡形式。但是一般認為凋亡和程序性死亡兩個概念可以交互使用，具有同等意義。雖然凋亡與壞死的最終結果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。壞死（necrosis）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。凋亡是細胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產生的應答有序變化的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。凋亡小體逐漸被鄰近的細胞或體內吞噬細胞所吞噬，凋亡細胞的殘余物質被消化后重新利用。形態(tài)學觀察細胞凋亡的變化是多階段的，細胞凋亡往往涉及單個細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，然后是細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體的DNA降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產生的不同長度的DNA片段約為180-200bp的整倍數(shù)，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連接部位被切斷，產生不同長度的寡聚核小體片段，實驗證明，這種DNA的有控降解是一種內源性核酸內切酶作用的結果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。細胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達和某些生物大分子的合成作為調控因子。如我們實驗室發(fā)現(xiàn)的TFAR-19就是在細胞凋亡時高表達一種分子，再如在糖皮質激素誘導鼠胸腺細胞凋亡過程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質合成抑制劑即能抑制細胞凋亡的發(fā)生。接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進入連續(xù)反應過程細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應的信號刺激后胞內一系列控制開關的開啟或關閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉導也不相同，客觀上說對細胞凋亡過程中信號傳遞系統(tǒng)的認識還是不全面的，比較清楚的通路主要有：1）細胞凋亡的膜受體通路：各種外界因素是細胞凋亡的啟動劑，它們可以通過不同的信號傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號，引起細胞凋亡，我們以Fas-FasL為例：Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與FasL結合可以啟動凋亡信號的轉導引起細胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導受體三聚體化，然后在細胞膜上形成凋亡誘導復合物，這個復合物中包括帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADD。Fas又稱CD95，是由325個氨基酸組成的受體分子，F(xiàn)as一旦和配體FasL結合，可通過Fas分子啟動致死性信號轉導，最終引起細胞一系列特征性變化，使細胞死亡。Fas作為一種普遍表達的受體分子，可出現(xiàn)于多種細胞表面，但FasL的表達卻有其特點，通常只出現(xiàn)于活化的T細胞和NK細胞，因而已被活化的殺傷性免疫細胞，往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細胞于死地。Fas分子胞內段帶有特殊的死亡結構域（DD,deathdomain）。三聚化的Fas和FasL結合后，使三個Fas分子的死亡結構域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結構域的蛋白FADD。FADD是死亡信號轉錄中的一個連接蛋白，它由兩部分組成：C端（DD結構域）和N端（DED）部分。DD結構域負責和Fas分子胞內段上的DD結構域結合，該蛋白再以DED連接另一個帶有DED的后續(xù)成分，由此引起N段DED隨即與無活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原發(fā)生同嗜性交聯(lián)，聚合多個caspase8的分子，caspase8分子遂由單鏈酶原轉成有活性的雙鏈蛋白，進而引起隨后的級聯(lián)反應，即Caspases，后者作為酶原而被激活，引起下面的級聯(lián)反應。細胞發(fā)生凋亡。因而TNF誘導的細胞凋亡途徑與此類似線粒體是細胞生命活動控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調控中心。實驗表明了細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子1（Apaf-1）結合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。線粒體還釋放凋亡誘導因子，如AIF，參與激活caspase?？梢姡毎蛲鲂◇w的相關組份存在于正常細胞的不同部位。促凋亡因子能誘導細胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細胞色素C從線粒體釋放的調節(jié)是細胞凋亡分子機理研究的關鍵問題。多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細胞凋亡途經。有人認為受體介導的凋亡途經也有細胞色素C從線粒體的釋放。如對Fas應答的細胞中，一類細胞（type1）中含有足夠的胱解酶8（caspase8）可被死亡受體活化從而導致細胞凋亡。在這類細胞中高表達Bcl-2并不能抑制Fas誘導的細胞凋亡。在另一類細胞（type2）如肝細胞中，F(xiàn)as受體介導的胱解酶8活化不能達到很高的水平。因此這類細胞中的凋亡信號需要借助凋亡的線粒體途經來放大，而Bid--一種僅含有BH3結構域的Bcl-2家族蛋白是將凋亡信號從胱解酶8向線粒體傳遞的信使。盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應過程，到目前為止，至少已有14種Caspase被發(fā)現(xiàn)，Caspase分子間的同源性很高，結構相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二類參與細胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點，此激活位點結構域為QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相對分子質量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其內部保守的天冬氨酸殘基經水解形成大（P20）?。≒10）兩個亞單位，并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個P20/P10異二聚體可來源于同一前體分子也可來源于兩個不同的前體分子。參與誘導凋亡的Caspase分成兩大類：啟動酶（inititaor）和效應酶（effector）它們分別在死亡信號轉導的上游和下游發(fā)揮作用。Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，Caspase分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個二聚體形成有活性的四聚體。去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步，也是必須的，但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽，Caspase活化基本有兩種機制，即同源活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關，一般來說后者是前者的結果，發(fā)生同源活化的Caspase又被稱為啟動caspase（initiatorcaspase），包括caspase-8,-10,-9，誘導凋亡后，起始Caspase通過adaptor被募集到特定的起始活化復合體，形成同源二聚體構像改變，導致同源分子之間的酶切而自身活化，通常caspase-8,10,2介導死亡受體通路的細胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體復合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細胞凋亡，則被募集到Cytc/dATP/Apaf-1組成的凋亡體（apoptosome）。同源活化是細胞凋亡過程中最早發(fā)生的capases水解活化事件，啟動Caspase活化后，即開啟細胞內的死亡程序，通過異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號放大，同時將死亡信號向下傳遞。異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執(zhí)行caspase（凋亡細胞的特征性表現(xiàn)，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質濃縮，細胞膜活化，細胞皺縮，最后形成由細胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細胞所吞噬，這一過程大約經歷30-60分鐘，Caspase引起上述細胞凋亡相關變化的全過程尚不完全清楚，但至少包括以下三種機制：正常活細胞因為核酸酶處于無活性狀態(tài)，而不出現(xiàn)DNA斷裂，這是由于核酸酶和抑制物結合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化（fragmentation）?，F(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonucleaseCAD），而把它的抑制物稱為ICAD。因而，在正常情況下，CAD不顯示活性是因為CAD-ICAD，以一種無活性的復合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DNA片段化即產生，有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成并顯示活性，提示CAD-ICAD以一種共轉錄方式存在，因而ICAD對CAD的活化與抑制卻是必需要的。Caspase可直接破壞細胞結構，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結構，使染色質（chromatin）得以形成并進行正常的排列。在細胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導致細胞染色質的固縮。Caspase可作用于幾種與細胞骨架調節(jié)有關的酶或蛋白，改變細胞結構。其中包括凝膠原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focaladhesionkinase,FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等。這些蛋白的裂解導致其活性下降。如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產生片段，使之不能通過肌動蛋白（actin）纖維來調節(jié)細胞骨架。除此之外，Caspase還能滅活或下調與DNA修復有關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細胞的增殖與復制受阻并發(fā)生凋亡。所有這些都表明Caspase以一種有條不紊的方式進行"破壞"，它們切斷細胞與周圍的聯(lián)系，拆散細胞骨架，阻斷細胞DNA復制和修復，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結構，誘導細胞表達可被其他的細胞吞噬的信號，并進一步使之降解為凋亡小體。細胞凋亡受到嚴格調控，在正常細胞Caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被活經隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應，發(fā)生不可逆的凋亡——細胞調節(jié)細胞凋亡的舉例如下。迄今為止，人類已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35，CrmA,IAPs，F(xiàn)LIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。1)P35和CrmA是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結果表明P35以競爭性結合方式與靶分子形成穩(wěn)定的具有空間位阻效應的復合體并且抑制Caspases活性，同時P35在位點DMQD！G被靶Caspases特異切割，切割后的P35與caspase的結合更強，CrmA（CytokineresponsemodferA）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但還未發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)P35和CrmA的同源分子。2)FLIPs(FLICE-imhibiroryproterins）能抑制Fas/TNFR1介導的細胞凋亡。它有多種變異體，但其N-端功能前區(qū)（Prodomain）完全相同，C端長短不一。FLIPs通過DED功能區(qū)，與FADD和Caspase-8，10結合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspase8，10募集到死亡受體復合體和它們的起始化。3）凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibitorsofApoptosisprotien）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質，首先是從桿狀病毒基因組克隆到，發(fā)現(xiàn)能夠抑制由病毒感染引起的宿主細胞死亡應答。其特性是有大約20氨基酸組成的功能區(qū)，這對IAPs抑制凋亡是必需要的，它們主要抑制Caspase3,-7，而不結合它的酶原，對Caspase則即可以結合活化的，又可結合酶原，進而抑制細胞凋亡。這一家族有眾多成員，如Mcl-NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它們分別既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多數(shù)成員間有兩個結構同源區(qū)域，在介導成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實現(xiàn)或功能調節(jié)的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，在一些白血病中Bcl-2呈過度表達。Bcl-2的亞細胞定位已經明確，它在不同的細胞類型可以定位于線粒體、內質網以及核膜上，并通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2具有保護細胞的功能，Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的一個成員，當誘導凋亡時，它從胞液遷移到線粒體和核膜。有人研究發(fā)現(xiàn)，細胞毒性藥物誘發(fā)凋亡時，核膜Bax水平的上升與lamin及PARP兩種核蛋白的降解呈正相關。用Bax寡核苷酸處理的細胞，只能特異地阻斷Lamin的降解，對PARP的降解不起作用。這種效應的調控機制仍然不清楚。細胞凋亡的調節(jié)是非常復雜的，參與的分子也非常多，還有很多不為我們所知的機理需要我們一步的探索。1)胸腺細胞成熟過程中的凋亡：胸腺細胞經過一系列的發(fā)育過程而成為各種類型的免疫活性細胞。在這一發(fā)展過程中，涉及了一系列的陽性細胞選擇和陰性細胞選擇過程。以形成CD4+的T淋巴細胞亞型及CD8+的T淋巴細胞亞型；同時，對識別自身抗原的T細胞克隆進行選擇性地消除，其細胞克隆死亡的機制主要是通過程序性細胞死亡。因此，正常的免疫系統(tǒng)發(fā)育的結局，既形成了有免疫活性的淋巴細胞，又產生了對自身抗原的免疫耐受。耐受機制的形成，主要靠識別自身抗原的T淋巴細胞克隆的程序性細胞死亡機制的活化。2）活化誘導的細胞死亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）是T淋巴細胞程序性死亡的又一個主要類型。正常的T淋巴細胞在受到入侵的抗原刺激后，T淋巴細胞被激活，并誘導出一系列的免疫應答反應。機體為了防止過高的免疫應答，或防止這種免疫應答無限制地發(fā)展下去，便有AICD來控制激活T細胞的壽命。實際上：T淋巴細胞的增殖與T淋巴細胞AICD具有共同的信號通路。T淋巴細胞受到刺激后就開始活化，活化以后的T淋巴細胞如果有生長因子的存在，即發(fā)生生殖反應，如果沒有或較少的生長因子的存在，則發(fā)生AICD。3）淋巴細胞對靶細胞的攻擊：免疫活性細胞，特別是淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK），是過繼性免疫治療的一種重要形式。在抗腫瘤、抗病毒及免疫調節(jié)中具有重要作用。這些免疫活性細胞在攻擊腫瘤細胞、病毒感染的細胞時，可誘導靶細胞發(fā)生程序性死亡。細胞凋亡之所以成為人們研究的一個熱點，在很大程度上決定于細胞凋亡與臨床病毒的密切關系。這種關系不僅表現(xiàn)在凋亡及其機制的研究，闡明了一大類免疫病的發(fā)病機制，而且由此可以導致疾病新療法的出現(xiàn)，特別是細胞凋亡與腫瘤及艾滋病之間的密切關系倍受人們重視。HIV感染引起艾滋病，其主要的發(fā)病機制是HIV感染后特異性地破壞CD4+細胞，使CD4+以及與其相關的免疫功能缺陷，易招致機會性感染及腫瘤，但HIV感染后怎樣特異性破壞CD4+細胞呢？一般認為，CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)顯著減少的原因，主要是通過細胞凋亡機制造成的。這不僅闡明了AIDS時CD4+T細胞減少的主要原因，同時也為AIDS的治療研究指明了一個重要的探索方向。一般認為惡性轉化的腫瘤細胞是因為失控生長，過度增殖，從細胞凋亡的角度看則認為是腫瘤的凋亡機制受到抑制不能正常進行細胞死亡清除的結果。腫瘤細胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈過表達狀態(tài)。這些基因的激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間有著極為密切的關系。癌基因中一大類屬于生長因子家族，也有一大類屬于生長因子受體家族，這些基因的激活與表達，直接刺激了腫瘤細胞的生長，這些癌基因及其表達產物也是細胞凋亡的重要調節(jié)因子許多種類的癌基因表達以后，即阻斷了腫瘤細胞的凋亡過程，使腫瘤細胞數(shù)目增加，因此，從細胞凋亡角度來理解腫瘤的發(fā)生機制，是由于腫瘤細胞的凋亡機制，腫瘤細胞減少受阻所致。因此，通過細胞凋亡角度和機制來設計對腫瘤的治療方法就是重建腫瘤細胞的凋亡信號轉遞系統(tǒng)，即抑制腫瘤細胞的生存基因的表達，激活死亡基因的表達。自身免疫病包括一大類難治性的免疫紊亂而造成的疾病，自身反應性T淋巴細胞及產生抗體的B淋巴細胞是引起自身免疫病的主要免疫病理機制，正常情況下，免疫細胞的活化是一個極為復雜的過程。在自身抗原的刺激作用下，識別自身抗原的免疫細胞被活化，從而通過細胞凋亡的機制而得到清除。但如這一機制發(fā)生障礙，那么識別自身抗原的免疫活性細胞的清除就會產生障礙。有人觀察到在淋巴增生突變小鼠中觀察到Fas編碼的基因異常，不能翻譯正常的Fas跨膜蛋白分子，如Fas異常，由其介導的凋亡機制也同時受阻，便造成淋巴細胞增殖性的自身免疫疾患。4)神經系統(tǒng)的退行性病變：老年性癡呆是神經細胞凋亡的加速而產生的。阿爾茨海默?。ˋD）是一種不可逆的退行性神經疾病，淀粉樣前體蛋白（APP）早老蛋白-1（PS1）早老蛋白-2（PS2）的突變導致家族性阿爾茨海默病（FAD）。研究證明PS參與了神經細胞凋亡的調控PSPS2的過表達能增強細胞對凋亡信號的敏感性。Bcl-2基因家族兩個成員Bcl-xl和Bcl-2參與對細胞凋亡的調節(jié)。線粒體是真核細胞的重要細胞器，是動物細胞生成ATP的主要地點。線粒體基質的三羧酸循環(huán)酶系通過底物脫氫氧化生成NADH。NADH通過線粒體內膜呼吸鏈氧化。與此同時，導致跨膜質子移位形成跨膜質子梯度和/或跨膜電位。線粒體內膜上的ATP合成酶利用跨膜質子梯度能量合成ATP。合成的ATP通過線粒體內膜ADP/ATP載體與細胞質中ADP交換進入細胞質，參與細胞的各種需能過程。1951年，巴黎第八大學榮譽教授Glucksmann提出正常脊椎動物發(fā)育中的細胞死亡。1966年，Saunders提出在形態(tài)發(fā)生中細胞死亡。1972年，Kerr提出細胞凋亡（apoptosis），說明這是在組織動力學方面有廣泛作用的一種基本生物學現(xiàn)象。1974年，Lockshin提出細胞程序性死亡。美國麻省理工學院教授Horvitz在研究線蟲發(fā)育時發(fā)現(xiàn)線蟲的每個細胞的位置、分裂與命運都是由遺傳決定的程序所精確地預先確定的。在構成成蟲體時有1090個細胞誕生，131個細胞死亡。1993年，哈佛大學醫(yī)學院細胞生物學系終身教授袁鈞瑛發(fā)現(xiàn)線蟲的死亡基因ced-3的產物在結構和功能上與哺乳類白細胞介素1β轉換酶有同源性。此后，屬于同一家族的十幾個相關基因陸續(xù)在哺乳動物基因組中被發(fā)現(xiàn)。統(tǒng)稱為胱冬肽酶（caspases）。1994年，瑞士蘇黎世大學分子生命科學研究所Hengartner發(fā)現(xiàn)線蟲的存活基因ced-9的產物與哺乳動物原癌基因bcl-2的產物相似。細胞凋亡的特征是細胞由于降解酶，主要是水解酶（蛋白酶與核酸酶）的作用，在近乎正常的細胞質膜內趨向死亡。這與壞死時細胞質膜早期破損不同。在細胞凋亡過程中，質膜脂雙層喪失二側不對稱性，磷脂酰絲氨酸暴露于細胞表面，從而導致被吞噬。有陸續(xù)報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。線粒體解聯(lián)的呼吸鏈會產生大量活性氧，氧化線粒體內膜上的心磷脂。實驗證明，用解偶聯(lián)劑mClCCP會導致淋巴細胞凋亡。而如果能穩(wěn)定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內膜的通透性轉變，這是由于生成了動態(tài)的由多個蛋白質組成的位于線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道（PT孔道）（圖1）。PT孔道由線粒體各部分的蛋白質與細胞質中蛋白質聯(lián)合構成。這包括細胞液蛋白：己糖激酶，線粒體外膜蛋白：外周苯并二嗪（benzodiazepine）受體與電壓依賴陰離子通道，線粒體膜間間隙蛋白：肌酸激酶，線粒體內膜蛋白：ADP-ATP載體，線粒體基質蛋白：親環(huán)蛋白D（通過一些實驗室的研究，以下諸點值得指出：⑴線粒體內膜通透性轉變既是細胞凋亡的必須條件，也是它的充足條件。⑵PT孔道打開后導致線粒體許多功能的致命性變化從而啟動了死亡途徑。⑶PT孔道作為許多生理效應的感受器（二價陽離子、ATP、ADP、NAD、ΔΨm、pH、巰基與多肽），整合了電生理、氧化還原與細胞代謝狀態(tài)的信息。⑷PT孔道的組成成分ADP-ATP載體是能量代謝的重要分子，由于ADP-ATP載體是由一個基因家族的幾個成員所編碼，它的表達有嚴格的組織專一性。因此，PT孔道在不同細胞中的調節(jié)可能稍有不同。⑸PT孔道的作用有自放大的效應。PT誘導ΔΨm耗散，而反過來mClCCP使ΔΨm去極化會導致PT。一些PT的結果例如ΔΨm耗散，活性氧的生成本身也會導致PT。這就說明PT會有正反饋，從而在細胞凋亡中有自摧毀的作用。反過來，如果能防止ΔΨm的耗散，就能避免氧化還原不平衡、磷酯酰絲氨酸的暴露與蛋白酶和核酸酶的激活。PT孔道有開放與關閉二種構象。PT孔道開放導致細胞凋亡。而PT孔道關閉能防止細胞凋亡。當PT孔道與環(huán)孢菌素A（cyclosporinA）或SH，或米酵菌酸（bongkrekacid）結合時PT孔道被關閉。在PT孔道開放時線粒體釋放細胞凋亡誘導因子（AIF）。AIF可能是一種蛋白水解酶，位于線粒體膜間間隙，它能被蛋白酶抑制劑如N-芐氧羰基-纈氨酰-丙氨酰-門冬氨酰氟甲基酮（PT孔道的作用并不相同。蒼術苷促進PT通道開放。這可能與二種抑制劑和ADP-ATP載體的結合部位不同有關。蒼術苷只能與ADP-ATP載體的胞液側結合而米酵菌酸可與ADP-ATP載體的胞液及基質二側結合。⑴若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，并不導致細胞核的變化。但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。⑵細胞死亡調節(jié)蛋白不論是抑制死亡的bcl-2家族還是促進細胞死亡的Bax家族均以線粒體作為靶細胞器。bcl-2蛋白的C端的疏水肽段能插入線粒體外膜。事實上相當量的bcl-2位于線粒體內外膜的接觸位點。⑶高表達bcl-2能防止ΔΨm的耗散，從而導致對蒼術苷、原卟啉I與mClCCP的不敏感與AIF釋放的抑制；反之，高表達Bax則導致ΔΨm的耗散。細胞凋亡與線粒體的結構與功能有著密切的關系。如果線粒體有大量PT孔道形成，細胞ATP濃度很快下降，則在致凋亡的蛋白酶被活化前細胞就壞死了。而如果PT孔道的誘導生成是一種比較緩和與持續(xù)的狀態(tài)，在細胞ATP濃度下降前專一的蛋白酶被激活；而另一方面ΔΨm的耗散產生的超氧陰離子則導致細胞死亡。細胞凋亡是一把雙刃劍。一方面是機體發(fā)育的正常過程，另一方面如果細胞凋亡過速，則會導致慢性退行性病變；如果細胞不凋亡就有可能導致癌變或對化療的不敏感。進一步研究線粒體在細胞凋亡中的作用，有助于深入了解細胞凋亡的機制與對疾病的防治。1)PS（磷脂酰絲氨酸）在細胞外膜上的檢測：PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發(fā)生，可能作為免疫系統(tǒng)的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發(fā)展階段。美國著名生物試劑公司CLONTECH和Invitrogen公司分別開發(fā)了多種標記的AnnexinV產品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標記的AnnexinV-EGFP（EnhancedGreenFluorescentProtein）及AnnexinV-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細胞分選）方法篩選凋亡細胞的基礎。由于融合蛋白AnnexinV-EGFP，EGFP與PS的結合比例為1：1，還可進行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的AnnexinV，可通過常用的酶聯(lián)顯色反應來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被AnnexinV，可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。這反應了細胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細胞細胞質中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統(tǒng)。當細胞內GSH的排除非?；钴S時，細胞液就由還原環(huán)境轉為氧化環(huán)境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯(lián)反應。由于GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，結合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后啟動caspase級聯(lián)反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：CO4）是定位在線粒體內膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時，它保留在線粒體內，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。ApoAlertTMCellFractionationKit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和CO4抗體標示細胞色素C和CO4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。在凋亡研究的早期，從形態(tài)學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導后線粒體轉膜電位會發(fā)生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlertMitochondrialMembraneSensorKit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。細胞凋亡晚期中，核酸內切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200bp的DNA片段。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法：1)TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）通過DNA末端轉移酶將帶標記的dNTP（多為dUTP）間接（通過地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法，直接熒光標記，地高辛介導熒光標記或過氧化物酶聯(lián)顯色，可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中，直接標記步驟少，操作簡便。而間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。當?shù)蛲黾毎壤^小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCRLadderAssayKit通過LM-PCR（ligation-mediatedPCR），連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生的核小體的梯度片段。LM-PCR檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現(xiàn)象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區(qū)重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-ezeTelemeraseDetectionKit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復序列，通過PCR反應，產物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNALadder現(xiàn)象（參見圖4）。Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測的試劑盒.同樣，這種檢測方法也不專對細胞凋亡，檢測結果也不純反應細胞凋亡的發(fā)生。研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，F(xiàn)as蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxicTcells）等靶細胞。Bcl-2和bcl-（長）作為抗凋亡（bcl-2和bcl-）的調節(jié)物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對它們進行檢測。隨著熒光定量PCR技術的發(fā)展，用定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。Invitrogen公司的AmplifluorApoptosisGeneSystems就根據這一新技術原理，通過檢測fas,bax-alpha和bcl-（長的）基因的mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。根據凋亡細胞固有的形態(tài)特征，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。1．未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。2．染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342），HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為5~1mg/ml。結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結構；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。細胞凋亡在胚胎發(fā)育、造血、免疫系統(tǒng)的成熟以及維護正常組織和器官的細胞恒定與生長平衡，乃至機體衰老方面都起著重要作用。因此，有關凋亡的研究在臨床和基礎等各個領域已經廣泛開展,凋亡細胞的檢測方法顯得非常重要。流式細胞儀(Flowcytometry,FCM)將流體噴射技術、激光光學技術、電子技術和計算機技術等集于一體,較其它方法有不可比擬的優(yōu)越性，既可定性又可定量,且具有簡單、快速和敏感性高的特點,可進行多參數(shù)和活體細胞分析。在APO的研究得到較為廣泛的應用，開辟了新途徑。在FCM系統(tǒng)中，被檢細胞在液流中通過儀器測量區(qū)時,經激光照射,細胞向空間360°立體角的所有方向散射光線,其中前向散射光(FSC)的強度與細胞大小有關,而側向散射光(SSC)的強度與質膜和細胞內部的折射率有關。細胞凋亡時,細胞固縮,體積變小,核碎裂形成,細胞內顆粒往往增多,故凋亡細胞FSC降低而SSC增高。細胞壞死由于胞體腫脹,細胞核亦碎裂分解故FSC和SCC均增高。正常細胞FSC高而SSC低。根據光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優(yōu)點是可以將光散射特性與細胞表面免疫熒光分析結合起來,用以區(qū)別辯認經這些特殊處理發(fā)生選擇凋亡的淋巴細胞亞型,也可用于活細胞分類。值得注意的是,根據FSC和SSC判斷凋亡細胞的可靠性受被測細胞形態(tài)上的均一性和核細胞漿比率影響很大,因此在某些淋巴細胞凋亡中,用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好而在腫瘤細胞凋亡中其可靠性較差。細胞凋亡時,核酸內切酶激活,導致DNA斷裂,這是凋亡的特征性表現(xiàn),也為FCM鑒別凋亡細胞奠定了基礎。而檢測細胞凋亡DNA斷裂的方法中,最常用、最簡便的就是細胞DNA含量分析。當細胞用乙醇、Trtion—100處理后細胞膜上出現(xiàn)漏洞,小片段DNA從細胞內釋放出來,使其DNA含量低于正常細胞的二倍體。用碘化丙啶(PI)染色后分析,可在二倍體C0/G1,峰前出現(xiàn)“亞二倍體”峰,即細胞凋亡峰(APO峰),根據APO峰可測出凋亡細胞百分率,該法簡單易行,可大批定量檢測凋亡標本,亦可同時分析細胞的細胞周期位置。另外,應用FCM方法通過對DNA和RNA的聯(lián)合檢測可以鑒別出G0期細胞,因此,可分析細胞凋亡與G1或G0細胸的關系。DNA降解的程度取決于凋亡的階段、細胞的類型和凋亡誘發(fā)因子的特性。染色過程中DNA的逸出量變化也影響FCM檢測結果。據研究,將高濃度的磷酸鹽———枸椽酸鹽緩沖液加入漂洗液中,可增高降解DNA的逸出量,從而提高鑒別凋亡細胞與正常細胞的能力。DNA含量測定在檢測細胞凋亡中的局限性在于其特異性和敏感性均不高。特異性不高是因為APO峰代表了一組細胞群體,包括凋亡細胞、機械損傷細胞、低DNA含量的細胞或不同染色體結構的細胞,在上述情況下,DNA與熒光染料的結合量均小。另外,非固定的細胞在低滲溶液中被溶解時,可導致大量的核碎片出現(xiàn),此時APO峰的細胞數(shù)目只代表了核碎片的數(shù)目,并不代表凋亡細胞數(shù)目。敏感性較差的原因是細胞凋亡早期只有DNA斷裂點出現(xiàn),但尚未出現(xiàn)DNA片段的大量丟失,所以該法不能檢出早期凋亡細胞和發(fā)生于S期或G2/M期的凋亡細胞,因為其實際含量不低于二倍體細胞所含的DNA,因此該法進行凋亡細胞分析時應結合其它形態(tài)或生化方法,以期更準確地分析細胞的凋亡狀態(tài)。3Y啶橙染色法(AcridineOrange,AO)AO可將細胞或細胞核中的雙鏈DNA和變性DNA染成不同顏色的熒光。AO插入雙鏈DNA中時,發(fā)綠色熒光;AO也可與單鏈或通過變性而產生的DNA單鏈發(fā)生作用,這時發(fā)出紅色熒光,因此,通過FCM檢測不同的熒光,可判斷凋亡的發(fā)生。在測定被標準化后,綠色和紅色熒光強度的量與總DNA含量成比例,紅色熒光與總體細胞(紅色加綠色)熒光的比率表示細胞中變性DNA的比例,因此,這種方法可用于評價DNA對原位變性的敏感性。有時候,凋亡細胞DNA降解不明顯,依賴于DNA降解來檢測細胞凋亡的方法如細胞DNA含量測定、DNA末端標記等就難以檢測到細胞凋亡變化。AO法檢測凋亡的原理不依賴于DNA片斷的產生,因此其最主要的優(yōu)點是可應用于寡核小體片段與凋亡不相平衡等情況,但AO染色法不能有效區(qū)分有絲分裂細胞和凋亡細胞。細胞生活狀態(tài)下,胞膜上的鈉-鉀泵、鈣泵等的作用,使細胞膜內外維持著不同離子的濃度梯度,包括Na+,K+,Cl-,Ca2+等,形成細胞膜電位。FCM可以檢測親脂性離子熒光染料在胞膜內外的分布,來測量膜電位的高低,以評價細胞的活力。Rh123是一種親脂性陽離子熒光染料,對細胞膜具有通透性,線粒體膜尤敏感。細胞存活狀態(tài)時,若丹明123通過細胞膜,積聚于線粒體發(fā)出綠色熒光。在細胞凋亡時,線粒體膜的轉運能力下降,電負性降低,故細胞線粒體積聚Rh123的能力也喪失,熒光強度降低,據此檢測細胞的凋亡變化。但應指出,在凋亡的早期階段,由于胞膜尚完整,大多數(shù)細胞器和細胞功能相對較好,因此,Rh123法對于早期凋亡細胞和活細胞的鑒別比較困難。細胞凋亡時,DNA斷裂早于形態(tài)學改變及DNA含量減少,原位末端標記(ISEL)是將滲入到凋亡細胞中的外源性核苷酸在酶和DNA的催化下與凋亡細胞因內源性核酸酶的激活而產生的單股或雙股斷裂相結合,較前述方面具更高靈敏性。通常有兩種方法:①DNA聚合酶I或klenow大片段介導的單位缺口平移(INST);②末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)。INST是利用DNA多聚酶將核苷酸整合到凋亡細胞內斷裂的DNA處的3’末端,同時水解5’末端,以修復DNA,若使用已標記的核苷酸即可顯示出有斷裂DNA的細胞。1993年,Gorczyca等提出了末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)標記法采檢測凋亡細胞的DNA斷裂,此種方法已得到廣泛應用。由于內源性核酸內切酶激活,細胞自身的染色質或D