出口果蔬汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢測(cè)方法

出口果蔬汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢測(cè)方法第一法環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢驗(yàn)(常規(guī)方法)處理過的樣品稀釋液，無菌過濾樣品并用20mL.清洗液(如無菌蒸餾水或去離子水)沖洗濾膜后，無菌取出濾膜，將第一個(gè)膜置于K瓊脂上，另一個(gè)膜置于YSG瓊脂或BAT瓊脂上，避免氣泡產(chǎn)生。與此同時(shí)，將對(duì)照菌株A.acidoterrestris和A.atidoraldarivs在相同平板上劃線。該方法檢出限為1CFU/對(duì)于不能過濾的樣品需進(jìn)行增菌處理。將100ml.加熱處理的樣品于45℃±1℃進(jìn)行增菌培養(yǎng)，下一步按6.1.7操作。該方法為定性檢測(cè)方法。7.1.5直接涂布平板取0,1ml.熱處理樣品接種于K瓊脂和YSG瓊脂或BAT瓊脂上。與此同時(shí)，將對(duì)照菌株A.ari-dwerrestris和A.acidcaldarias在相同平板上劃線，下一步按6.1.6操作。該方法適合污染量較大的樣品檢測(cè)。7.1.6平板培養(yǎng)將所有平板和增菌肉湯于45℃±1℃培養(yǎng)2d~5d,觀察有無菌落生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過程中可以將平板置于密封袋或其他密封容器中來避免培養(yǎng)基干燥。7.1.7增菌肉湯的傳代培養(yǎng)增菌培養(yǎng)2d后，輕混增菌肉湯，取一菌環(huán)菌液接種于K瓊脂和YSG瓊脂或BAT瓊脂上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，如果(至少培養(yǎng)2d)無典型的環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌菌落生長(zhǎng)，將肉湯增菌5d后，再進(jìn)行傳代接種，每次傳代培養(yǎng)的同時(shí).將對(duì)照菌株A.aciduterrestris和A.atidocaldarivs進(jìn)行劃線培養(yǎng)。7.1.8可疑菌確證試驗(yàn)檢查K瓊脂，YSG和BAT球脂上的菌落，選擇每種菌落形態(tài)的多個(gè)菌進(jìn)行確證試驗(yàn)。從每個(gè)挑選的菌落一部分劃線接種于一塊K瓊脂平板、一塊中性pH培養(yǎng)基平板(如：菌落計(jì)數(shù)平板、TSA或腦心侵液瓊脂)和兩個(gè)YSG瓊脂平板，將其中1個(gè)YSG瓊脂平板在65℃±1℃培養(yǎng)2d~3d,其余各平板在45℃±1℃培養(yǎng)3d~5d。YSG和BAT能夠支持目前已知的環(huán)狀脂助酸芽泡桿菌屬中各個(gè)種的組菌生長(zhǎng)，與K瓊脂相比，更寬泛的環(huán)狀脂肪酸芽抱桿菌會(huì)在兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出可見菌落。愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生確證實(shí)驗(yàn)參見附錄B。7.1.9結(jié)果觀察具體見表1。表1確證試驗(yàn)結(jié)果分析陰性”見YSG7.1.10結(jié)果報(bào)告綜合以上確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告，報(bào)告結(jié)果如下：a)采用過濾方法檢測(cè)的樣品，報(bào)告10g樣品中檢出(或未檢出)環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌的數(shù)量；b)采用增菌方法檢測(cè)的樣品，報(bào)告10g樣品中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性(或陰性);c)采用直接涂平板方法檢測(cè)的樣品，報(bào)告0.01g樣品中檢出(或未檢出)環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌的數(shù)量。7.2終產(chǎn)品(果藍(lán)汁、飲料等可直接消費(fèi)產(chǎn)品)中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌的檢測(cè)7.2.1預(yù)增菌加工(熱處理)后直接取樣的樣品，無需再熱體克處理，取整包裝的成品置于45℃±1℃中預(yù)增菌7.2.2涂布平板無菌打開包裝，取0.1mL增菌液分別涂布接種于K瓊脂、YSG瓊脂或BAT瓊脂平板。各平板于45℃±1℃培養(yǎng)2d.如無菌生長(zhǎng)，可延長(zhǎng)至5d。7.2.4確證試驗(yàn)具體見7.1.8。7.3翅市商品中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌的檢測(cè)7.3.1預(yù)增菌取整包裝的成品置于45℃士1℃中預(yù)增菌7d。7.3.2涂布平板無菌打開包裝，取0.1ml.樣品液或增菌液分別涂布接種于K瓊脂、YSG瓊脂或BAT瓊脂平板。假如無菌落生長(zhǎng)，如果已懷疑腐敗，但直接涂布平板未檢出環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌，應(yīng)先預(yù)增菌和熱休克處理后再進(jìn)行檢測(cè)?？扇?00ml.樣品按5,1,2方法進(jìn)行熱處理，45℃±1℃培養(yǎng)后，接種于K瓊脂、YSG瓊脂或BAT瓊脂平板。45℃±1℃培養(yǎng)2d,如無菌生長(zhǎng)，可延長(zhǎng)至5d。各平板于45℃±1℃培養(yǎng)2d,如無菌生長(zhǎng)，可延長(zhǎng)至5d。7.3.4確證試驗(yàn)具體見7.1.8。8試劑和材料除特別說明以外，所用試劑為分析純或生化試劑。5氯化鎂。氯化鎂。8.1水：應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。8.2DNA提取試劑：0.1%Chelex100水溶液。8.310×PCR緩沖液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化鉀，15mmol/1.下游；5'-GTGTTGCCGACTCTCGTG-3’8.5探針；5'-FAM-CGGAATTGCTAGTAATCGC-TAMRA-3’8.6TagDNA聚合酶。8.7dNTP?dATP,dCTP,d8.8YSG液體培養(yǎng)基和BAT液體培養(yǎng)基(見附錄A.3和附錄A.5)8.9脂環(huán)酸芽孢桿菌質(zhì)控菌株：ATCC49025。9檢測(cè)程序見圖2。圖2熒光PCR方法檢測(cè)脂環(huán)酸芽孢桿菌程序圖10.1取樣和增菌取樣前消毒試樣包裝的開啟處和取樣工具。以無菌操作取試樣10mL(g),加在90mL的YSG或BAT液體培養(yǎng)基中，振搖使試樣充分混合后，45℃±1℃恒溫振蕩培養(yǎng)24h～48h。10.2模板DNA制備取增菌液1ml.加到1.5ml.無菌離心管中，8000r/min離心5min,盡量吸棄上清液；加入50μl.DNA提取液(使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸取),混合后沸水浴5min,12000r/min離心5min,取上清液以待檢測(cè)(必要時(shí)測(cè)定DNA的濃度和純度，如不能及時(shí)檢驗(yàn)，可將上清液于-20℃保存)。也可按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取模板DNA。反應(yīng)體系總體積為25pL,其中含：10×PCR緩沖液2.5pL,引物(10gmol/L)各1pl.,探針7吐溫80將上述成分混合，加入11.去離子水。121℃高壓滅菌15min。冷卻至50℃,用25%蘋果酸調(diào)節(jié)pH值至3.7。將上述成分混合，加入1L去離子水。121℃高壓滅菌15min。冷卻至50℃,用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH成分同YSG瓊脂培養(yǎng)基，但不包括瓊脂。調(diào)節(jié)pH值后再121℃高壓滅菌15min。a)CaCl?·2H?OKH?PO?8酵母提取物葡萄糖痕量礦物質(zhì)溶液去離子水500mL用1NH?SO?或者1NNaOH調(diào)節(jié)pH值至4.0。121℃高壓滅菌15min后冷卻至150℃。痕量礦物質(zhì)溶液NaMoO?·2H?O去離子水去離子水121℃高壓滅菌15min后冷卻至50℃。值至4,0,倒平板，無菌等體積混合a)和b),必要時(shí)調(diào)節(jié)pH值至4,0,倒平板，成分同BAT瓊脂培養(yǎng)基，但不包括瓊脂。調(diào)節(jié)pH值后再121℃高壓滅菌15min。(資料性附錄)愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生確證試驗(yàn)——過氧化物酶方法從45℃培養(yǎng)的YSG瓊脂板上分離可疑菌落，通過該試驗(yàn)確定從香草醛酸中產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚的能力。本試驗(yàn)根據(jù)該菌和過氧化物酶反應(yīng)后在YSG-香草醛酸培養(yǎng)基上的顏色反應(yīng)進(jìn)行結(jié)果判定。過氧化物A.herburius和其他幾個(gè)種產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。但并不是所有的環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌菌株均有產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚的能力，試驗(yàn)結(jié)果會(huì)隨著接種量和菌種進(jìn)行變化。因此，在試驗(yàn)過程中需分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照如A.acidwterrestris,A,atidaraldarius與被測(cè)分離物在同等條件下進(jìn)行測(cè)試。從YSG平板上選擇5~10個(gè)菌落置于含有100mg/kg香草酸的YSG肉湯中(YSGVA肉湯),混勻。接種陽(yáng)性對(duì)照菌與陰性對(duì)照菌于YSGVA中，混勻。培養(yǎng)兩個(gè)YSGVA肉湯，一個(gè)用來作空白對(duì)照，一個(gè)用作愈創(chuàng)木酚對(duì)照。將所有肉湯于45℃±1℃水溶鍋中搖菌，最少3h,從水溶鍋中取出。按附錄2要求加入各種試劑。記錄過氧化物酶試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性或陰性。如果結(jié)果不確定，加大接種量或延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間重新進(jìn)行檢測(cè)。B.2.1接種5～10個(gè)測(cè)試菌落于含有100×10°香草醛酸的1mLYSG肉湯(YSGA)中。B.2.2接種陽(yáng)性對(duì)照菌(A.acidoterrestri)和陰性對(duì)照菌(A.acidoraldarius)。另兩個(gè)YSGVA肉湯管，分別用作空白對(duì)照和愈創(chuàng)木酚對(duì)照。B.2.3所有管置于45℃±1℃水浴解中進(jìn)行搖菌。最少3h。B.3.1從水浴鍋中取出所有管。B.3.2加100gL提供的愈創(chuàng)木酚溶液于愈創(chuàng)木酚對(duì)照管中。B.3.3各管中加入1ml.磷酸鹽緩沖液(試劑1)。B.3.4加入20μL的H?O?(試劑2)