SNT 0175-2010進出口食品中彎曲菌的檢測方法

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準代替SN0175—1992進出口食品中彎曲菌的檢測方法2010-03-02發(fā)布2010-09-16實施I本標準代替SN0175-1992《出口食品中彎曲桿菌檢驗方法》?！黾恿说凹暗爸破返犬a(chǎn)品的樣品制備方法；——修改及完善了增菌培養(yǎng)方法；—增加了紅嘴鷗彎曲菌等四種彎曲菌種及亞種的生化圖譜；—增加了API鑒定試驗；——增加了選擇性培養(yǎng)基改良CCDA培養(yǎng)基。本標準的附錄A為規(guī)范性附錄。本標準由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標準起草單位：中華人民共和國湖南出入境檢驗檢疫局，中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局，中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫局，中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局。本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：1SN/T0175—2010進出口食品中彎曲菌的檢測方法本標準規(guī)定了進出口食品中彎曲菌的檢測方法。本標準適用于進出口食品中彎曲菌的檢測。3.1微需氧條件及相關設備：最佳微需氧條件為5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣，選擇合適大小的3.4具過濾網(wǎng)的無菌均質(zhì)袋。3.9乙酸鉛條。3.10麥氏單位標準濁度。4.1.20.1%蛋白胨水：見A.1.4。4.1.6哥倫比亞血瓊脂平板：見第A.3章。4.1.7.3半胱氨酸-HCl。2三糖鐵反應試驗革蘭氏染色溫度耐受試驗.01%三糖鐵反應試驗革蘭氏染色溫度耐受試驗.01%甘氨酸生長試驗4.2.33%過氧化氫。4.2.6革蘭氏染色試劑：見第A.11章。4.2.7硝酸鹽檢測試劑A和B:見第A.12章。彎曲菌檢測程序見圖1。制備樣品接種Bolton肉湯(微需氧)接種Skirrow和改良CCDA平板(微需氧)哥倫比亞血平板(微需氧)培養(yǎng)%氯化鈉生長試驗彎曲菌陰性圖1彎曲菌檢測程序圖36樣品的運送和保存在樣品的運送及保存過程中不要將樣品冷凍，應在4℃±2℃溫度條件下保存并盡快進行檢測，同時注意不使樣品干燥。7樣品制備所有樣品的制備均應在無菌條件下操作，制樣過程應盡快完成。當存在大量其他菌群時，應使用樣品的最初制備液以及1:10的Bolton增菌肉湯稀釋液進行增菌7.2龍蝦仁和蟹爪7.3凈膛畜體或難以分割成25g的樣品適量樣品放入無菌均質(zhì)袋中，加入200mL0.1%蛋白胨水。均質(zhì)2min～3min,通過滅菌紗布過濾至250mL的離心瓶中。16000g離心15min。棄去上清液，用10mL0.1%的蛋白胨水懸浮沉淀。吸取3mL于100mLBolton增菌肉湯中。7.4液態(tài)蛋黃或全蛋混合物將同一批兩個樣本混合制成混合樣，每個樣本25g。稱取25g混合樣品于100mLBolton增菌肉湯中。輕輕攪拌之后，再移取25mL于另一瓶100mLBolton增菌肉湯中。分別制成兩種稀釋度的增7.5貝類(已去殼)取100g～200g樣品，放入滅菌攪拌機或其他合適的滅菌容器中混勻。將25g樣品混合物放入500mL培養(yǎng)瓶中，加入225mLBolton增菌肉湯，充分混勻。取混勻后液體25mL至另一瓶225mLBolton增菌肉湯中。制成1:10和1:100的增菌液。取2L~4L水樣，若樣品為添加過次氯酸鈉等消毒劑的含氯水樣時，應于每1L水樣加入5mL根據(jù)樣品量選擇各種直徑大小的0.45μm無菌濾膜過濾樣品。過濾后濾膜放入100mLBolton增將藥簽放入裝有10mLBolton增菌肉湯的50mL錐形燒瓶中，折斷并棄去接觸手棍子部分。重新7.8.1鮮牛奶樣品收集時，如果樣品pH低于7.6,應用滅菌的碳酸鈉(Na?CO?)溶液調(diào)節(jié)樣品pH到7.2±0.2,并立即送往實驗室，再測試pH,調(diào)節(jié)到7.5±0.2。稱取50g樣品，20000g離心20min,棄上清液。用7.8.2冰淇淋和其他乳制品冰淇淋以及其他冷凍乳制品應先融化，稱量時盡可能除去糖塊或其他固體成分，同7.8.1步驟，4稱取50g放入具過濾襯套的均質(zhì)袋中，加入50mL0.1%蛋白胨水，均質(zhì)器8000g～10000g均質(zhì)30s。移開過濾襯套，排出液體5s。將濾液進行離心，如同7.8.1中鮮牛奶的離心操作，將稱取25g樣品(如果是水果或蔬菜取50g)置于具過濾襯套的無菌均質(zhì)袋中，再添入100mL對生產(chǎn)或加工時間為10d之內(nèi)的樣品，或為乳制品的樣品，將其放入36℃±1℃培養(yǎng)箱中前增菌對冷凍時間超過10d的樣品以發(fā)為水樣和貝殼類的樣品，使用5h前增菌法。30℃±1℃培養(yǎng)3h后轉(zhuǎn)移到36℃±1℃培養(yǎng)2h。曲菌，制樣時可設置重復，增菌溫度保持在36℃±1℃培養(yǎng)52-h.分別挑取培養(yǎng)24h和48h的增菌液劃線接種于表面晾干的改良CCDA或改良Skirrow氏平板上，最好同時接種兩種平板；同時將增菌液使用0.1%的蛋白胨水稀釋100倍，劃線接種于上述平板培接種后的平板倒置于42℃±1℃培養(yǎng)24h～48,h。24h觀察生長情況。若檢驗胎兒彎曲菌應于彎曲菌菌落在改良CCDA平板上呈現(xiàn)兩種形態(tài)；每個平板選取3個～5個生長典型或疑似菌落制濕片觀察。8.2.1形態(tài)觀察對生長典型或疑似菌落涂濕片進行形態(tài)觀察并重新接種哥倫比亞血瓊脂平板微需氧環(huán)境下42℃±1℃(胎兒彎曲菌36℃±1℃)培養(yǎng)24h～485剛從平板上接種的菌細胞具有運動性，并且呈螺旋狀運動，不過也有將近10%的菌不具有運動性。較用鉑絲接種環(huán)選取血平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，所有的彎曲菌均應呈現(xiàn)氧化酶陽性結(jié)果。8.2.3革蘭氏染色挑取血平板上的生長菌落進行革蘭氏染色，使用0.5%石炭酸品紅作為復染劑。彎曲菌為革蘭氏8.3.1過氧化氫酶試驗挑取血平板上的生長菌落于清凈載玻片上，滴加一滴3%的過氧化氫溶液，30s內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為8.3.2三糖鐵(TSI)高層斜面反應挑取血平板上菌落3個～5個穿刺并劃線接種TSI高層斜面。微需氧環(huán)境下35℃~37℃培養(yǎng)8.3.3.1試驗前準備挑取生長菌落接種至5mL0.1%的蛋白胨水混合均勻，調(diào)節(jié)菌濃度至1個麥氏單位標準濁度。使用該菌液進行以下8.3.3.2～8.3.3.]試驛。劃線接種稀釋培養(yǎng)物至血平板上，接種三個平板。于25℃、35℃~37℃和42℃下微需氧環(huán)境培8.3.3.3改良半固體培養(yǎng)基中生長情況d)硝酸鹽還原試驗：培養(yǎng)5d后向8.3.3.4抗生素抑制試驗別浸有萘啶酮酸和先鋒霉素溶液的5mm～6mm直徑的藥紙片。微需氧環(huán)境下36℃±1℃培養(yǎng)只有基礎成分的培養(yǎng)基。微需氧環(huán)境下35℃~37℃培養(yǎng)4d。彎曲菌不利用葡萄糖或者其他糖，管內(nèi)8.3.3.61%馬尿酸鈉水解試驗69.1彎曲菌生化鑒別見表1。表1彎曲菌屬各個種的生化性狀空腸彎曲菌空腸彎曲菌德萊亞種大腸彎曲菌紅嘴鷗彎曲菌胎兒彎曲菌胎兒亞種豚腸彎曲菌烏普薩拉彎曲茵±——+D—35℃~37℃生長十十十十+++十士++D十+硝酸鹽還原十-十十十十十3.5%氯化鈉————H?S試驗(乙酸鉛試劑條)十十十十十十十H?S,TSI斜面——D——過氧化氫酶試驗++++++氧化酶試驗十十十十+十十運動性(涂片法)十十+十++1%甘氨酸生長試驗十十十十十十+葡萄糖利用試驗— 馬尿酸鈉水解試驗十十—抗萘啶酮酸鹽試驗SSRRRS先鋒霉素抗性試驗RRRRSSS注：“+”,90%或者更多的菌落呈陽性反應；“—”,90%或者更多的菌落呈陰性反應；“D”,11%～89%菌落呈陽性反應；“R”,具有抗性；“S”,具敏感性。在新鮮配制的TSI斜面(3d)上產(chǎn)生少量的硫化氫。b有報道空腸彎曲菌對萘啶酮酸具抵抗性。c有報道胎兒彎曲菌胎兒亞種對先鋒霉素具抵抗性。(mL)(針對不同樣品取樣量)。7胎兒彎曲菌在37℃培養(yǎng)48h。每個平板倒入1mL冷凍培養(yǎng)基，輕輕刮下菌苔，所得菌懸液轉(zhuǎn)移到滅為了保護實驗室人員的安全，應由具備資格的工作人員檢測致病菌，所有培養(yǎng)物應小心處置，并按GB19489中的有關規(guī)定執(zhí)行。12廢棄物處理和防治污染措施檢測過程中的廢棄物應經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。8o.01g(規(guī)范性附錄)A.1Bolton增菌培養(yǎng)基A.1.1基礎增菌肉湯培養(yǎng)基及配制A.1.1.1培養(yǎng)基肉胨水解乳蛋白肉胨酵母浸膏氯化鈉丙酮酸鈉重亞硫酸鈉無水碳酸鈉蒸餾水將培養(yǎng)基充分溶解，調(diào)pH值至7.4±0.2,分裝至螺口瓶中121℃滅菌15min。待培養(yǎng)基冷卻后蓋緊瓶蓋。在使用前添加50mL馬(并)血和4mLA.1.3中的四種抗生素溶液(每種抗生素分開-20℃保存，反復凍融3次即可使用。保存期不應超過6個月。溶解后沒有使用過的血可以進行反復A.1.3彎曲菌增菌培養(yǎng)肉湯添加劑配制100mL蒸餾水中溶解0.5g甲氧芐氨嘧啶乳酸鹽，過濾除菌。4℃保存期為1年。每1L培養(yǎng)基中添加4mL抗生素溶液，其終濃度為20mg/L,或者可使用甲氧芐氨嘧啶鹽酸鹽替代：在0.05mol/LHCl中加入0.5g甲氧芐氨嘧啶50℃下攪拌溶解，用蒸餾水定容至100mL。每9A.1.3.3萬古霉素0.5g溶解到100mL蒸餾水中過濾除菌，4℃保存期為2個月。每1L培養(yǎng)基中添加4mL抗生素A.1.3.4放線菌酮1.25g溶解至20mL～30mL無水乙醇中并加水定容至100mL,過濾除菌。4℃保存期為1年。每1L培養(yǎng)基中添加4mL抗生素溶液，其終濃度為50mg/L?？捎脙尚悦顾谺代替放線菌酮。A.1.3.5配制要求每種添加成分應獨立配制。頭孢菌素鈉、萬古霉素保存時間較短，應在使用前適量配制。少量體積A.1.4.1培養(yǎng)基.蛋白胨蒸餾水A.1.4.2配制溶解蛋白胨于蒸餾水中，校正pH至7.0,121℃滅菌20min。A.2.1.1培養(yǎng)基牛肉浸膏動物組織酶解物細菌碳水解酪蛋白脫氧膽酸鈉硫酸亞鐵丙酮酸鈉瓊脂粉酵母膏蒸餾水A.2.1.2配制a)頭孢菌素鈉：稱取0.8g溶解至100mL蒸餾水中過濾除菌。每1L瓊脂培養(yǎng)基中添加4mLb)利福平：稱取0.25g緩慢加入到60.0mL～8水定容至100.0mL,一20℃保存期為1年。每1L培養(yǎng)基中添加4.0mL抗生素溶液，其終濃度為10.0mg/L。A.2.2改良Skirrow氏培養(yǎng)基及配制瓊脂15甲氧芐氨嘧啶5.0mg萬古霉素10.0mg多粘菌素B2500.0(國際單位)無菌凍融去纖維羊(馬)血70.0mLA.3哥倫比亞血瓊脂平板動物組織酶消化物23.0gA.3.2配制成分中加入除菌去纖維綿羊血50.0mL,混勻。每平板倒入15.0mL。在4℃±2℃避光保存期為7d。A.4用于生化鑒定的半固體培養(yǎng)基A.4.1基礎培養(yǎng)基成分a)中性紅溶液(0.2%):溶解0.2g中性紅于10mL乙醇；b)硝酸鉀(1%):于無中性紅的250mL半固體培養(yǎng)基中加入2.5g;c)甘氨酸(1%):于含有中性紅的250mL半固體培養(yǎng)基中加入2.5g;d)氯化鈉(3.5%):于含有中性紅的250mL半固體培養(yǎng)基中加入7.5g:e)半胱氨酸-HCl(0.02%):于含有中性紅的250mL半固體培養(yǎng)基中加入0.05g。A.4.2配制煮沸基礎培養(yǎng)基，250.0mL分裝成4份。3份培養(yǎng)基中加入2.5mL中性紅，再加入甘氨酸，氯化鈉和半胱氨酸-HCl。沒有加入中性紅的培養(yǎng)基中加入硝酸鉀。每份培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為7.4±0.2。分裝帶螺旋帽的試管，每支10.0mL。121℃高溫滅菌20min。蛋白胨20.0酚紅0.025gA.5.2配制入0.2%酚紅水溶液12.5mL,搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高的底層。121℃高壓滅菌15min,放置高層斜面?zhèn)溆?。A.6.1培養(yǎng)基0.2%溴麝香酚藍0.03g瓊脂3g葡萄糖10.0gA.7半固體儲存培養(yǎng)基A.7.1培養(yǎng)基彎曲菌增菌肉湯(Bolton)檸檬