生物化學實驗論文 從啤酒酵母中提取蔗糖酶

./題名：酵母蔗糖酶的提取純化與活力測定__宋烙學院：長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心__綠色國際班__2012013914162013年12酵母蔗糖酶的提取純化與活力測定XX工業(yè)大學綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心宋烙摘要：采用自溶法從啤酒酵母中提取蔗糖酶,通過離心、熱提取、95%乙醇沉淀提取、QSepharose-柱層析法來對蔗糖酶進行純化。至于活力的測定,首先利用3,5-二硝基水楊酸〔DNS〕法測定5min內酶能催化生成葡萄糖的量來對得到的各個提取液進行蔗糖酶活力的測定。然后再通過Folin-酚法測定蔗糖酶蛋白質含量,之后就可以計算出各個提取液的比活力。最后,用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法來測定蔗糖酶的相對分子質量。關鍵詞：蔗糖酶；提取純化；酶活力；蛋白質含量；相對分子質量TheExtractionMethodofBeerYeastSucroseandVitalityTestZhejiangUniversitySongLuoAbstract:Theautolysisextractssucrosefrombeeryeast.Then,purifyingthesucrosebycentrifugalization,hotextraction,95%ethanolsedimentextraction,andQ-Sepharose-columnchromatography.Asforcalculatetheradiooflive,firstofall,using3,5-dinitrosalicylicacid<DNS>tocalculatetheeachextractingsolution’sradiooflivebymeasurehowmuchsucrosethesucrosecancatalysis.Afterthat,calculatingthecontentofsucrosebyusingLowrymethod.,soit’savailabletocalculateeachextractingsolution’sspecificactivity.Finally,weusedSDS-polyacrylamidegeleletrophoresistomeasurethesucrose’srelativemolecularmass.Keyword:sucrose；extraction；vitality；specificactivity；relativemolecularmass前言：本實驗的是一個綜合性的教學實驗,主要是為了讓學生養(yǎng)成規(guī)X的科學實驗習慣,樹立嚴謹的科研作風。本次綜合性的實驗既保留了一些旨在加強學生基本實驗方法和技能訓練的傳統(tǒng)實驗,也引進了一些新近發(fā)展起來的生化實驗技術。旨在培養(yǎng)我們的動手能力和良好的科研素質,使我們有一個完整的實驗鍛煉過程,培養(yǎng)了我們科研思維和獨立展開科研工作的能力。蔗糖酶〔Sucrase,EC.26〕又稱轉化酶〔Invertase〕,1928年Dumas等首先指出酵母菌發(fā)酵蔗糖時必須有這種酶的存在,蔗糖酶廣泛存在于微生物、植物、動物中[1]。蔗糖在蔗糖酶的催化下生成葡萄糖和果糖。然而,蔗糖酶有多種同工酶,分別處于不同的亞細胞位置,生化特性也不盡相同。[2][3]蔗糖酶在啤酒酵母細胞匯總存在著兩種形式。一種存在細胞膜外細胞壁中高度糖基化的胞外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分,含有50%糖的成分。該酶是啤酒酵母蔗糖酶的主要形式。而另外一種是存在于細胞膜內側細胞質中的低糖基化的胞內蔗糖酶。材料與方法1.1材料與儀器材料啤酒酵母〔市售〕儀器高速冷凍離心機[Thermo<SORVALL>BIOFOGESTRATOS]；紫外分光光度計T6新世紀；恒溫水浴槽；DYY-6D型電泳儀；凱氏定氮儀等。試劑醋酸鈉〔AR〕；甲苯〔AR〕；4mol/L醋酸；95%乙醇；0.5mol/LTris-HClPH7.3緩沖液；0.05mol/LTris-HClPH7.3緩沖液；濃硫酸；硫酸鉀與硫酸銅混合粉末；30%NaOH溶液；2mol/lNaOH溶液；0.5mol/lNaOH溶液；2%硼酸溶液；混合指示劑；0.01mol/LHCl標準溶液；試劑A〔堿性銅試劑〕；試劑B〔酚試劑〕；標準濃度牛血清蛋白溶液〔200μg/ml〕；30%丙烯酰胺溶液；10%的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺；10%過硫酸銨溶液；分離膠緩沖液；濃縮膠緩沖液；2*SDS-樣品緩沖液；SDS-電極緩沖液；10%SDS;染色液；脫色液；標準蛋白液；3,5-二硝基水楊酸；葡萄糖標準溶液〔0.2mg/ml〕；5%蔗糖〔用0.2mol/lPH4.6醋酸緩沖液配置〕；1mol/lNaCl的0.05mol/LTris-HClPH7.3緩沖液；QSepharose等。1.2方法蔗糖酶粗品的制備將20g鮮酵母倒入250m1錐形瓶中、加入1.6g醋酸鈉,攪拌15～20min放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫60h,使得酵母自溶。然后加入10ml蒸餾水,搖勻,再用4℃、15000r／min離心10min,取中間層的液體,重新倒入離心管,再用4℃、15000r／min離心10min。仔細倒出上層清液,用量筒測出體積VA。取出3ml蔗糖酶的初提純將初提取液A倒入50ml的錐形瓶中,加入4mol/L醋酸3.2ml左右,使溶液的pH值約為4.5左右,搖勻,50℃恒溫水浴中保溫30min,在保溫過程中不斷地搖動錐形瓶,取出后迅速在冰浴中冷卻,冷卻液于4℃、15000r/min離心10min,仔細地倒出上層清夜,測量體積,記為VB,。此提取液為熱提取液B。取出3ml用于后續(xù)的活力測定,將熱提取液B倒入100ml燒杯中,把燒杯放入冰浴中,輕輕攪拌并緩慢加入95%乙醇的溶液,體積與熱提取液B相同。整個過程不少于35min,再繼續(xù)攪拌10min。將燒杯內的液體全部移入離心管中,白色固體保留待用,4℃蔗糖酶的純化首先用QSepharose凝膠填充離子交換柱,然后,在梯度發(fā)生器中的與柱相連接的杯子中加入30ml0.05mol/LTris-HClpH7.3緩沖液,在另一只杯中加入30ml含1mol/LNaCl的上述緩沖液。在除盡連接管中的氣泡后,在低離子強度溶液的杯子中放入一顆攪拌子。將柱子與恒流泵相連,放松夾子,打開恒流泵,用大于5個柱體積<CV>的0.05mol/LTris-HClpH7.3緩沖液進行沖洗。將緩沖液放至剛好與交換劑表面相切,加緊柱下端的夾子,取0.5ml乙醇提取液C緩慢地加到交換柱上,放松柱下端的夾子,使樣品剛好全部流進交換劑內,夾緊夾子,再加3ml緩沖液。加樣以后的流出液都要收集,每一管收集3ml。將柱子與恒流泵相連,放松夾子,用恒流泵控制流速為3ml/min,每管收集3ml,先用0.05mol/LTris-HClpH7.3緩沖液25ml洗穿透鋒,接著連接梯度發(fā)生器,進行線性梯度洗脫,直到梯度發(fā)生器內的緩沖液全部用完為止,再用0.05mol/LTris-HClpH7.3緩沖液配制的1mol.LNaCl溶液25ml洗脫。再用0.5mol/L的NaCl洗3CV,再用5CV水洗,對離子交換劑進行再生。在紫外分光光度計上測出每管在280nm處的紫外吸光度OD值,畫出管數與吸光度OD值的關系曲線。在滴定板中滴2滴5%蔗糖,再加2滴待測洗脫液,用玻璃棒攪勻,放置5min,浸入葡萄糖試紙,1s后取出,60s比較顏色深淺,用"+"的數目表示酶活力的大小,取活力最高的2～3管為柱分離液D。組號23910111516活力大小+++++++++++++++++++蔗糖酶活力的測定取6支試管,分別按表1-1加入各種試劑。將各試管內液體混合均勻,在沸水浴中加熱5min。取出后立即用冷水冷卻到室溫,于540nm波長處測OD值,以葡萄糖的毫克數為橫坐標,OD值為縱坐標,畫出標準曲線。表1-1葡萄糖標準曲線的制作Form1-1theformofmakingglucosestandardcurve’ssample試管號012345葡萄糖00.801.001.201.401.60蒸餾水3.002.202.001.801.601.403,5-二硝基水楊酸1.501.501.501.501.501.50總體積4.504.504.504.504.504.50將前個實驗所得四部分提取液用冷蒸餾水按比例稀釋：初提液A〔1：200〕；熱提取液B〔1：200〕；乙醇沉淀提取液C〔1：200〕；柱分離液D〔1：20〕。并取8支試管,按表1-2加入各種試劑。表1-2酶的催化反應Form1-2enzyme’scatalysisreaction項目初提液A〔1：200〕熱提取液B〔1：200〕乙醇沉淀提取液C〔1：200〕柱分離液D〔1：20〕加樣A對A樣B對B樣C對C樣D對D樣酶液/ml2.002.002.002.002.002.002.002.002mol/LNaOH/ml0.05—0.05—0.05—0.05—35℃5%蔗糖〔35℃2.002.002.002.002.002.002.002.00加入蔗糖,立即搖勻開始計時,35℃2mol/LNaOH/ml—0.05—0.05—0.05—0.05總體積/ml4.504.504.504.504.504.504.504.50從每管中按照表格1-3取出反應液〔V測〕進行還原糖的測定,方法和葡萄糖的標準曲線制作相同,如果測得的OD值不在標準曲線X圍內,則可增加或減少取樣量,直到OD值在標準曲線X圍內為止。計算4.5ml溶液中所含還原糖的量〔以葡萄糖計〕,用表格記錄下來。蔗糖酶的活力單位定義為：在一定條件下〔pH為4.6、溫度為35℃總活力單位數=mg/V測*4.5/2*V總*n式中,mg為V測體積測出的葡萄糖的毫克數；n為酶液稀釋倍數；V總為各種提取液在提取過程中得到的總體積。酶的回收率=〔各提取液的總酶活/處提液A的總酶活力〕*100%蔗糖酶蛋白質含量測定與比活力計算將試管從0～5號編碼,按表1-3分別加入各試液。試劑A加畢混勻后,靜置10min,再向各試管加試劑B后放置10min,再加第二次,每加一次均應立即迅速充分混合。完全加畢后,放置55℃取出試管置冷水中冷卻1min。以空白0號為對照,660nm處測定各管OD值,以牛血清蛋白微克數為橫坐標。OD660值為縱坐標,用適當比例在標準坐標紙上繪制標準曲線圖。將前面所得到的四個部分提取液按照比例稀釋。初提液A〔1：100〕,熱提取液B〔1：100〕,乙醇提取液C〔1：20〕,D不稀釋,從中各取出0.5ml進行蛋白質含量測定。從標準曲線上查知對應蛋白微克數,計算出總蛋白量和比活力。表1-3標準曲線配制加樣表Form1-3theformofmakingstandardcurve’ssample試試劑量/ml所加試劑管號012345標準牛血清蛋白液/ml00.20.40.60.81.0H2O/ml4.54.34.13.93.73.5試劑A/ml1.01.01.01.01.01.0試劑B/ml第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2總體積/ml6.06.06.06.06.06.0OD660計算:總蛋白=〔mg/0.5〕*n*V總比活力=總活力單位/總蛋白微量凱氏定氮法測總蛋白氮再用微量凱氏定氮法測熱提取液B的總蛋白,將50ml克氏燒瓶內加入2ml樣液。然后各加硫酸鉀-硫酸銅混合物約20mg以與濃硫酸2ml。燒瓶口插一小漏斗,燒瓶置通風櫥內的消化架上加熱消化,開始時應該控制火力,直到消化液透明并呈淡綠色為止冷卻,將消化液移到25ml的容量瓶中定容。取100ml錐形瓶2只,洗凈,用吸管各加入2%硼酸溶液10.0ml以與混合指示劑4滴。如果瓶內液體呈現葡萄紫色,可以再加硼酸溶液5.0ml,蓋好備用。如果錐形瓶內的液體呈現綠色,需要重新洗滌。蒸汽發(fā)生器內盛有加入數滴H2SO4的蒸餾水,加熱后,產生之蒸汽經過貯藏液、反應室至冷凝管,冷凝的液體流入接受瓶。每次使用前,需要蒸汽洗滌10min左右,然后將一只盛有硼酸液和指示劑的錐形瓶放置冷凝管下端,并將冷凝管的管口插入酸液內,繼續(xù)蒸餾1～2min,如硼酸液顏色不變,表示儀器洗凈,否則需再洗。移去酸液,蒸餾1min,用水沖洗冷凝管口,吸取反應室殘液。在冷凝管下放置一盛有硼酸液以與指示劑的錐形瓶,并使得冷凝管口插入酸液液面下約0.5cm處。取5ml消化液,由小漏斗加入反應室,用蒸餾水洗滌小漏斗,洗滌液由小漏斗流入反應室。用小量筒量取10ml30%NaOH溶液,倒入小漏斗,放松彈簧夾,讓NaOH溶液緩緩流入反應室,當小漏斗內仍有少量NaOH溶液時,加緊夾子,再加約有3ml蒸餾水于小漏斗內,同樣緩緩放入反應室,并留有少量水在漏斗內作水封。至此,即可蒸餾。開始蒸餾后立即注意硼酸溶液顏色的變化,當酸液由葡萄紫變成綠色后,再蒸餾3min。然后降低錐形瓶,使得冷凝管口離開酸液液面約1cm。再蒸餾1min,用少量蒸餾水沖洗冷凝管口,移去錐形瓶,蓋好,準備滴定。每一次反應結束后,必須把反應室內的殘液吸去,洗凈；即為切斷電源,讓貯液管溫度突然下降,即可使反應室殘液吸至貯液。用0.01mol/LHCl溶液滴定錐形瓶中的硼酸液至淡葡萄紫色,記錄所消耗的HCl溶液量。樣品含氮量〔mg/ml〕=〔A-B〕*N*14.008*V2/V1*V2式中A——滴定樣品用去的HCl溶液體積,ml；B——滴定空白用去的HCl溶液體積,ml；N——鹽酸的摩爾濃度,mol/L14.008——每摩爾氮原子質量,g/mol;V1——燒瓶內加入樣液的體積,mlV2——消化液轉移到容量瓶中定容的體積,mlV3——加入反應室的消化液體積,ml計算所得結果為樣品總氮含量,如欲求蛋白質含量,用蛋白氮乘以6.25即得。SDS測蛋白質的相對分子質量將玻璃板洗凈、干燥后裝置成凝膠膜,保證其不漏水。按下列比例配置12%的分離膠：分離膠緩沖液2.5ml,30%丙烯酰胺貯存液4.0ml,10%SDS0.1ml,10%過硫酸銨溶液0.1ml,加水3.3ml,混合均勻后,加入10%TEMED40μl。迅速混合后倒入兩塊玻璃板之間,小心用移液槍加進一層水覆蓋,讓其聚合30～60min。分離膠高度約占玻璃板高度的2/3左右。分離膠聚合好后,出去水層,用濾紙條吸干。按下列比例配置濃縮膠：濃縮膠緩沖液0.5ml,30%丙烯酰胺貯存液0.67ml,10%過硫酸銨溶液40μl,加水2.7ml,混合均勻后,加入10%TEMED40μl,迅速混合后,倒在分離膠上層,并插入梳子,聚合后,小心取出梳子,避免混入氣泡,用濾紙去掉樣品槽內的水分。將樣品和標準蛋白質溶液分別與2*SDS-樣品緩沖液等體積混合,100℃水浴加熱3～5min。將制備好的凝膠平板裝進垂直平板電泳槽。下槽放進SDS-電極緩沖液,凝膠底部保證沒有氣泡。將與SDS-樣品緩沖液混合后的樣品液和標準蛋白各20μ在電極槽中倒入pH8.3Tris-HCl電極緩沖液,內含有0.1%SDS即可進行電泳。開始時電流為10mA左右,待樣品進入分離膠后,改為20～30mA,當染料前沿距離凝膠底部邊緣1.5cm時候,停止電泳關閉電源。電泳結束后,取出凝膠平板,移去玻璃板,將凝膠浸泡于染色液中,染色4h或過夜,然后用脫色液脫色,數小時換一次脫色液,直至背景無色。凝膠脫色后,可浸泡在7%醋酸溶液中保存,也可放在一X與膠片尺寸相宜的濾紙上。以標準蛋白質相對分子質量的對數〔lgMw〕為縱坐標,相對遷移距離為橫坐標作圖,得到標準曲線。然后根據樣品蛋白質分子的相對遷移距離,從標準曲線上查出其相對分子質量。相對遷移距離=蛋白質分子遷移距離〔cm〕/染料遷移距離〔cm〕結果與分析2.1初步提純樣品體積表2-1初提純各樣品體積Form2-1thevolumeofeachpurifiedsample組別樣品A樣品B樣品C體積/ml15.313.95.2總體積/ml15.317.38.22.2QSepharose層析柱法由于實驗時,誤將9號試管內的分離液倒掉,又將3號試管與10號試管混合,這將會造成后面的活性測試實驗一連續(xù)的影響,這導致后面的結果均要將此考慮進去。圖2-1出管數與吸光度OD值的關系曲線圖Picture2-1thecurveofODandtubes2.3蔗糖酶活力測定圖2-2葡萄糖標準曲線圖Fig2-2Thestandercurveofglucose表2-2各提取液的活力與回收率Form2-2theactivityofeachextractingsolutionandrecovery項目初提液A熱提取液B乙醇提取液C柱分離液D總活力單位數/U11475934257272959回收率/%10081.449.925.8在熱提取液B到乙醇提取液C的過程中,蔗糖酶損失的最多,高達30%,可知在乙醇提純過程中,冰浴并不充分,溫度并不足夠的低,或者說乙醇在滴加時,速率過大,導致局部乙醇的濃度過大,使得蔗糖酶發(fā)生了不可逆的形變。柱分離損失了24%的主要從濃度梯度的變化時候從柱體上過早脫落下來的酶?；蛘呤钦f酶沒有完全的固定在交換柱上面。與此同時,制作一個線性關系良好的葡萄糖標準曲線也是起著關鍵作用。2.4蔗糖酶蛋白質量測定與比活力計算FForm2-2Thestandercurveofprotein表2-3標準曲線配制加樣表Form2-3theformofmakingstandardcurve’ssample試試劑量/ml所加試劑管號012345標準牛血清蛋白液/ml00.20.40.60.81.0H2O/ml4.54.34.13.93.73.5試劑A/ml1.01.01.01.01.01.0試劑B/ml第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2總體積/ml6.06.06.06.06.06.0OD6600.000.2030.3230.4430.5630.683表2-4酵母蔗糖酶的純化Form2-4purificationoinvertasefromyeastStepVtotal<ml>Totalactivity<U>Protein<mg>SpecificActivity<U/mg>Proteinyield<%>Enzymeyield<%>Purification<fold>SampleA15.311934380.35831.381001001SampleB17.310587.6222.47847.5958.588.71.5SampleC8.3572733.631170.298.8447.95.4SampleD109.32959.232.19991.908.4724.82.9提取液B到提取液C時,其內含的蛋白質含量急劇下降了6.6倍,大量的雜蛋白被出去,雖然因此失去了54%的酶活性,但是也能看出用乙醇來提取蔗糖酶的選擇性很高,其比活力也從1.5直接上升了3.6倍,達到了5.4。從數據中,我們可以得到樣品D的比活力不如樣品C的比活力要高,這不是方法的問題,而是在柱層析的結尾時,我不小心將提純出來的液體倒掉,為了后續(xù)實驗的進行。我將有穿透峰的收集液充當產品收集。2.5微量凱氏定氮法測總蛋白表2-5樣品含氮量的記錄Form2-5therecordofthenitrogencontentofsample組別123456平均滴定所用HCl〔ml〕2.803.332.974.463.083.542.95樣品含氮量〔mg/ml〕27.4632.6529.1243.7330.2034.7128.93由實驗結果中可以得到,原來的sampleB體積為19.7ml,可得到sampleB中有3561.76mg的蛋白質,顯然與用Folin-酚法,測出來的數據相差甚遠,再與同學的數據相比較,認識到本實驗是一個失敗的實驗,得到了極為不準確的數據。造成實驗失敗的原因：1.使用前,微量凱氏定量儀沒有清洗干凈,內壁沾有硫酸沒有洗干凈。2.兩組使用的5%硼酸在使用前已經被污染了。3.在實驗過程中發(fā)生了倒吸現象,后沒有清洗干凈。2.6SDS測定蛋白質的相對分子質量FigFig2-6Thestandercurveofprotein圖2-6蛋白質標準曲線Fig2-6Thestandercurveofprotein表2-7各組條帶蛋白質相對分子質量Form2-7Relativemolecularmassofeachprotein組別條帶1條帶2條帶3條帶4條帶5標準9740066200430003100020100B9386269464536673416623706C959036654034909D69464圖2-8電泳結果圖Fig2-8theresultofelectrophoresis從電泳結果得到的樣品D中的蛋白質的相對分子質量來看,蔗糖酶的相對分子質量為69464。在網上查閱了相關資料后,得到了酵母內的蔗糖酶的相對分子質量大約在710000左右,電泳的圖樣呈帶狀,且顏色比較淡,從而在測量其長度時,造成了一定的誤差。同時,我也看到了在標準曲線上,該回歸線的線性關系,不是十分良好,這主要是在電泳時,夾板過緊而導致膠帶被擠出來。從另一個角度來看,我們也可以觀察到,樣品內的帶數在慢慢的減少,也可以反映出在此過程中樣品內的雜蛋白在一次次地減少,A到B熱提取過程中,大量種類的雜蛋白被出去。討論3.1酵母蔗糖酶提取其他方法比較酵母蔗糖酶的提取較常使用甲苯自溶法,除此還有凍融法和SDS抽提法。表3-1不同蔗糖酶提取方法比較[10]Form3-1comparingwithdifferentwaytoextractsucrose蔗糖酶提取方法提取液酶活性實驗優(yōu)點實驗缺陷甲苯自溶法偏低試劑簡單、價格低廉其耗時長、重復性差、酶活性低凍融法一般,是甲苯自溶的534倍。可以確定