EDU-細(xì)胞增殖檢測(cè)

EDU-細(xì)胞增殖檢測(cè)熒光顯微鏡檢測(cè)方法(以96孔板，A549貼壁細(xì)胞為例)細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔4×103~1×105細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段。藥物處理(可選)客戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行各種藥物處理。EdU標(biāo)記1.1用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000：1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量50μMEdU培養(yǎng)基；注：1)EdU濃度與孵育時(shí)間相關(guān)，短時(shí)間孵育(<2h)宜采用高濃度(10~50μM)，長(zhǎng)時(shí)間孵育(>24h)宜采用低濃度(1~10μM)；2)如果需配置10μMEdU培養(yǎng)基，需調(diào)整為5000：1稀釋比例；3)配置好的培養(yǎng)基的保存時(shí)間取決于培養(yǎng)基的性質(zhì)。表1EdU培養(yǎng)基及染色反應(yīng)液的使用量參考EdU培養(yǎng)基染色反應(yīng)液

注：1)*表示貼壁細(xì)胞通常采用的培養(yǎng)容器，EdU培養(yǎng)基與染色反應(yīng)液用量以覆蓋細(xì)胞為宜；2)懸浮細(xì)胞EdU用量依據(jù)培養(yǎng)體積而定。1.2每孔加入100μL50μMEdU培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，棄培養(yǎng)基；注：1)最佳孵育時(shí)間與細(xì)胞周期相關(guān)(表2)，大多數(shù)細(xì)胞系均可采用2小時(shí)孵育時(shí)間；2)EdU培養(yǎng)基用量以沒(méi)過(guò)細(xì)胞為宜，但需要保證EdU孵育時(shí)間內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)供給(表1)；1.3PBS清洗細(xì)胞1~2次，每次5分鐘。注：清洗目的是將未滲入DNA的EdU洗脫，清洗方式依據(jù)不同的細(xì)胞類型而定，貼壁不牢的細(xì)胞請(qǐng)降低清洗強(qiáng)度。表2EdU孵育時(shí)間設(shè)定參考細(xì)胞系人胚胎細(xì)胞人成纖維細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞周期30min18h21h孵育時(shí)間5min2h2h

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注：1)EdU孵育時(shí)間取決于細(xì)胞周期，一般為細(xì)胞周期的1/10至1/5，但大多數(shù)細(xì)胞系均可采用2h孵育時(shí)間。孵育時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞增殖數(shù)量就越多；2)*考慮到細(xì)胞培養(yǎng)基、溫度、濕度、光線等其他因素的影響，具體實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞群體細(xì)胞周期會(huì)有所變化。EDU-細(xì)胞增殖檢測(cè)全文共2頁(yè)，當(dāng)前為第2頁(yè)。表3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)EdU孵育濃度及時(shí)間參考EDU-細(xì)胞增殖檢測(cè)全文共2頁(yè)，當(dāng)前為第2頁(yè)。注：如果您有采用BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，可以參照BrdU實(shí)驗(yàn)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞固定化2.1每孔加入50μL細(xì)胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室溫孵育30分鐘，棄固定液；注：1)低濃度的多聚甲醛有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保持，當(dāng)需要抗體染色時(shí)，需采用TritonX-100透化細(xì)胞以利于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。2)可采用其他方式進(jìn)行細(xì)胞固定。2.2每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5分鐘后，棄甘氨酸溶液；注：目的是中和多聚甲醛，保證染色反應(yīng)體系，當(dāng)采用其他方式進(jìn)行細(xì)胞固定時(shí)可酌情省略此步驟；2.3每孔加入100μLPBS，脫色搖床清洗5分鐘，棄PBS；2.4(加強(qiáng))每孔加入100μL滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10分鐘;PBS清洗1次，5分鐘。注：當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行其他抗體染色時(shí)，或由于某些細(xì)胞類型對(duì)染料的吸附性較高，可能需要增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性。普通細(xì)胞可以省略。Apollo染色3.1每孔加入100μL的1XApollo?染色反應(yīng)液(表3)，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液；注：1)染色液用量與細(xì)胞量相關(guān)，以覆蓋細(xì)胞為宜(表1)；2)孵育時(shí)間可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整范圍為10~30分鐘。表4Apollo?染色反應(yīng)液的配置參考(現(xiàn)用現(xiàn)配)

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注：1)*表示通常配制的Apollo?反應(yīng)液的體積足以進(jìn)行5～10個(gè)孔(96孔板)染色；2)按順序配制適量1XApollo?染色反應(yīng)液，以免破壞正常的反應(yīng)體系(現(xiàn)用現(xiàn)配，30分鐘用完)；3)試劑E為白色粉末，較易氧化，使用后請(qǐng)旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需更換；粉末較難準(zhǔn)確稱量，稱量誤差范圍可稍微放寬，但不應(yīng)超過(guò)±20%。3.2加入100μL滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2~3次，每次10分鐘，棄滲透劑；3.3(加強(qiáng))每孔每次加入100μL甲醇清洗1~2次，每次5分鐘；PBS清洗1次，每次5分鐘。注：由于某些細(xì)胞對(duì)染料的吸附性較高，需采用加強(qiáng)方式洗脫以降低染料背景。普通實(shí)驗(yàn)可以省略。DNA染色4.1用去離子水按100：1的比例稀釋試劑F，制備適量1XHoechst33342反應(yīng)液，避光保存；4.2每孔加入100μL1XHoechst33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液；4.3每孔每次加入100μLPBS清洗1~3次；4.4客戶可選擇進(jìn)行其他染色步驟，否則每孔加入100μLPBS保存待用。其他染色(自備)(可選)客戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體染色(注：染料兼容性請(qǐng)參照表4)。圖像獲取及分析建議染色完成后立即進(jìn)行觀測(cè);如果條件限制，請(qǐng)避光4℃濕潤(rùn)保存待測(cè)，但不應(yīng)超過(guò)3天。注：調(diào)試儀器時(shí)，請(qǐng)將曝光時(shí)間調(diào)整為30ms左右，盡量不要>1s。表5配套染料的相關(guān)波長(zhǎng)信息550565Cy3653667Cy5Hoechst33342350461DAPI

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EDU-細(xì)胞增殖檢測(cè)全文共4頁(yè)，當(dāng)前為第4頁(yè)。注：1)*熒光顯微鏡宜采用Hoec