石油微生物中文資料

石油微生物中文資料-綜合打印版微生物采油是利用微生物的活動(dòng)及其代謝物進(jìn)行強(qiáng)化采油的技術(shù)[1～3]。本文采用從油田水中分離出的菌種,以青海七個(gè)泉油田原油為研究對(duì)象,進(jìn)行了較詳細(xì)的室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究,目的是弄清所篩選出的微生物對(duì)七個(gè)泉油田原油的作用及效果,以尋求提高該油田原油采收率的新途徑。結(jié)論：1,原油受微生物作用后,族組分和分子結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化。高碳數(shù)正構(gòu)烷烴降解成低碳數(shù)烷烴;芳烴骨架不受影響,支鏈斷裂;代謝產(chǎn)物有有機(jī)酸、氣體和酮、醚類物質(zhì)。2,原油受微生物作用后物性變化較大,粘度、凝點(diǎn)、蠟含量均降低。3,微生物提高原油采收率是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果。如短鏈有機(jī)酸可與巖石礦物反應(yīng),增大低滲透地層的滲透率,氣體可以增加地層壓力,產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)可改變巖石表面性質(zhì)。向廷生，何正國(guó)，佘躍惠等，微生物提高原油采收率的機(jī)理研究，石油勘探與開發(fā)，1998,25（4）：53－57[摘要]以地層微生物地化活動(dòng)的活化作用為基礎(chǔ)的提高石油采收率生物技術(shù),在大港孔店油田做了先導(dǎo)性試驗(yàn)(2001～2004年)。微生物的活化作用是通過注水井循環(huán)導(dǎo)入充氣水和補(bǔ)充含N,P的礦物鹽而獲得的。這項(xiàng)生物技術(shù)的使用引起地層微生物的活化,這個(gè)活化首先是在注水井的近井底區(qū)域,接著是在沿著水動(dòng)力學(xué)方向一致的區(qū)域進(jìn)行。第一階段,需氧烴降解微生物的活性增加,導(dǎo)致地層水碳酸氫鹽和乙酸鹽含量的增加;第二階段,在缺氧區(qū)域甲烷產(chǎn)生菌被激活。本源MEOR先導(dǎo)性試驗(yàn)表明,地層水中的微生物指標(biāo)與生產(chǎn)井的產(chǎn)量有關(guān),通過試驗(yàn)多采出16000余噸原油。本源MEOR(微生物提高原油采收率)方法以地層本源微生物活性作用為基礎(chǔ),在注水中引入空氣和磷酸鹽以及含氮的礦物質(zhì)。第一階段,需氧的和兼性厭氧的烴氧化菌被激活,由于重油的部分氧化,形成乙醇、脂肪酸、生物表面活性劑、CO2、多糖和其他組分,這些物質(zhì)一方面是原油釋放劑,另一方面用作厭氧微生物(包括甲烷產(chǎn)生菌)激活劑。第二階段,甲烷產(chǎn)生菌在厭氧層被激活,產(chǎn)生CH4溶于原油后,就會(huì)增加原油的流動(dòng)性,進(jìn)而提高石油采收率。在詳細(xì)調(diào)查大港油田孔二北斷塊本源微生物區(qū)系組成基礎(chǔ)上,于2001年4月開展激活本源微生物提高原油采收率先導(dǎo)試驗(yàn),在每年4～9月間循環(huán)注入含氮、磷源的充氣水;到2004年底;取得了良好效果。周玲革,佘躍惠,馮慶賢,激活地層本源微生物提高稠油采收率,石油天然氣學(xué)報(bào)(江漢石油學(xué)院學(xué)報(bào)),2005,27(1):93-95摘要用最大或然數(shù)(MPN)微生物計(jì)數(shù)法測(cè)定油田深度為1.0～1.5m地表土壤樣品的甲烷氧化菌數(shù)量,結(jié)合氣相色譜法測(cè)定土壤中甲烷氧化菌消耗甲烷的速率,來分析供試地區(qū)甲烷氧化菌的異常,推斷地下天然氣藏的分布。甲烷氧化菌的數(shù)量與其活性具有正相關(guān)性,但不具有明顯的規(guī)律特征。甲烷氧化菌的數(shù)量明顯高于背景值。供試油田土壤的濕度、pH值和巖性對(duì)甲烷氧化菌的數(shù)量與活性影響不明顯。通過對(duì)油田20個(gè)測(cè)點(diǎn)土壤中甲烷氧化菌數(shù)量及相關(guān)井位的研究,結(jié)果表明甲烷氧化菌的數(shù)量可以作為指示天然氣藏分布的指標(biāo)。試驗(yàn)油田東部及東南部為有利氣勘探區(qū)。該方法作為天然氣勘探的一種輔助手段,具有快速、低成本的優(yōu)點(diǎn)。在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下,油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移〔1〕。土壤中以輕烴氣體作為其唯一碳源和能源的專性微生物在油藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常。通過檢測(cè)烴氧化菌的數(shù)量和活性,可以判斷地表微生物異常,從而指示地下油氣藏的分布〔2〕。甲烷氧化菌屬于一類特殊的烴氧化菌群。它僅能利用C1化合物,而不能利用糖類或其它有機(jī)物,具有高度的專一性。進(jìn)行選擇性培養(yǎng)可以將甲烷氧化菌從其它細(xì)菌中分離出來。Hanson等綜述了甲基營(yíng)養(yǎng)菌的生態(tài)及其在甲烷物質(zhì)循環(huán)中的作用〔3〕。甲烷新陳代謝的過程由Leadbetter〔4〕首先提出。已知微生物首先通過甲烷加氧酶活化甲烷,在有氧條件下生成甲醇,進(jìn)一步氧化可生成甲醛。甲醛可以被同化產(chǎn)生生物質(zhì)或被氧化成CO2并產(chǎn)生能量。天然氣中98%以上是甲烷氣,甲烷易于往地表擴(kuò)散,甲烷氧化菌的異?？梢灾甘镜叵碌V藏的分布。1.土壤樣品的采集及其處理土壤樣品采自位于江漢盆地邊緣的湖北松滋油田,該油田系剛開發(fā)不久的新油田,鉆井?dāng)?shù)量較少。采樣區(qū)域主要分布于農(nóng)田或菜園,在設(shè)計(jì)的測(cè)網(wǎng)和測(cè)線點(diǎn)上鉆孔取樣。野外測(cè)量采用衛(wèi)星定位儀定點(diǎn),測(cè)網(wǎng)間距為500×500m。采集的土壤樣品要保證不受污染,確保所采樣品是從所要求的深度采樣,采樣層必須為氧化帶。由于該油田地下水位較高,應(yīng)該在地下水位上采樣,所以深度一般為1.2～1.5m。樣品應(yīng)盡可能在10℃以下保存,帶回實(shí)驗(yàn)室時(shí)后自然風(fēng)干,研細(xì)后過100目篩。稱20g2.甲烷氧化菌培養(yǎng)基組成甲烷氧化菌培養(yǎng)基:KH2PO41.0g,Na2HPO42.9g,MgSO4·7H2O1.0g,KNO31.0g,微量元素溶液10mL,瓊脂18g,蒸餾水990mL,pH6.8。培養(yǎng)基配制后分裝厭氧試管,每管4.5mL,用異丁基橡膠密封。向廷生,周俊初,袁志華,利用地表甲烷氧化菌異?？碧教烊粴獠?天然氣工業(yè),,2005:25(3):41～43[摘要]在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下,油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移。土壤中以輕烴氣體作為其唯一碳源和能源的專性微生物在油藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常。通過檢測(cè)甲烷氧化菌及烴氧化菌的數(shù)量和活性,可以判斷地表微生物異常,從而指示地下油氣藏的分布。傳統(tǒng)的分析方法是采用經(jīng)典的微生物分離純化技術(shù),操作過程煩瑣,且工作量大。因此研究新的微生物分離方法已成為微生物勘探技術(shù)推廣應(yīng)用的必然。采集0.4m和1.5m深度油田地表土壤樣品,探討了不同的甲烷氧化菌分離方法;通過實(shí)驗(yàn)分離出了兩株形態(tài)特異的專一性甲烷氧化菌,為甲烷氧化相關(guān)基因的克隆提供了材料。并且用氣相色譜對(duì)甲烷氧化菌活性進(jìn)行了測(cè)定。在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下,油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移。土壤中以輕烴氣體作為其唯一碳源和能源的專性微生物在油藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常。通過檢測(cè)烴氧化菌的數(shù)量和活性,可以判斷地表微生物異常,從而指示地下油氣藏的分布。甲烷氧化菌屬于一類特殊的烴氧化菌群。它僅能利用C1化合物,而不能利用糖類或其他有機(jī)物,具有高度的專一性。進(jìn)行選擇性培養(yǎng)可以將甲烷氧化菌(MOB)從其他細(xì)菌中分離出來。Hanson等綜述了甲基營(yíng)養(yǎng)菌的生態(tài)及其在甲烷物質(zhì)循環(huán)中的作用。甲烷新陳代謝的過程由Leadbetter首先提出。已知微生物首先通過甲烷加氧酶活化甲烷,在有氧條件下生成甲醇,進(jìn)一步氧化可生成甲醛。甲醛可以被同化產(chǎn)生生物質(zhì)或被氧化成CO2并產(chǎn)生能量。另一類可利用C2～C5輕烴作碳源的細(xì)菌在有微量烴類存在的環(huán)境中即可生長(zhǎng),這類細(xì)菌的專一性較差,除利用烴類外,也可利用多糖和其他有機(jī)物。長(zhǎng)期在微量輕烴環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物在C2～C5為碳源的培養(yǎng)基中也可以迅速生長(zhǎng);而在非輕烴環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物在C2～C5為碳源的培養(yǎng)基中需要一段適應(yīng)期,生長(zhǎng)緩慢。利用這一差別可以檢測(cè)土壤中輕烴的豐度。C2～C5烴氧化菌的異?？芍甘镜叵掠筒氐姆植?。天然氣中98%以上是甲烷氣,甲烷氧化菌的異常可以指示地下氣藏的分布。下面研究油田地表土壤甲烷氧化菌的分離鑒定及活性測(cè)定。1試驗(yàn)方法1)樣品采集試驗(yàn)所用土樣取自松滋油田,采樣按無菌操作要求進(jìn)行,采樣深度分別為014m和115m。共采集19個(gè)樣品,帶回實(shí)驗(yàn)室后于4℃2)土樣預(yù)處理取50g土樣于無菌操作臺(tái)晾干,并粉碎成細(xì)顆粒狀(近粉末狀)。3)MOB的純化采用液體10倍稀釋分離培養(yǎng)與固體10倍稀釋滾管分離相結(jié)合的方法進(jìn)行分離,采用固體斜面純化分離培養(yǎng)物。4)MOB活性測(cè)定稱取20g土樣加入到干熱滅菌處理的血清瓶中,蓋上軟塞并向其中注入5ml甲烷,蓋上外蓋于30℃恒溫培養(yǎng)。采用氣相色譜檢測(cè)甲烷含量,檢測(cè)條件如下:氫離子火焰檢測(cè)器(FID),進(jìn)樣量0.2ml,總流速40.8ml/min,柱流速1.6ml/min,柱溫354)固體斜面純化培養(yǎng)的菌落形態(tài)觀察經(jīng)過固體斜面純化培養(yǎng)分離出兩株MOB,形態(tài)特征為:①青色菌落,類似于霉菌,橢圓形,個(gè)體很大,100倍油鏡可見細(xì)胞核及處于雙核狀態(tài)的細(xì)胞;②白色菌落,培養(yǎng)基內(nèi)部呈圓點(diǎn)狀,露于空氣中類似于霉菌,有纖維狀菌絲體,中間有隔膜微球菌,二連球菌,鏈球菌,低倍鏡下呈短桿狀,鏈桿狀。1)通過對(duì)土樣進(jìn)行不同的選擇性培養(yǎng)及隨后的分離純化工作,得到了兩株形態(tài)特異的甲烷氧化菌,是否屬于新的種屬仍有待于進(jìn)一步研究。2)甲烷氧化菌活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明在含水量很低的情況下(土樣幾乎呈粉末狀)甲烷氧化菌對(duì)外源性甲烷的氧化能力非常有限。3)篩分出的兩株MOB中有一株菌落顏色呈青色,類似于霉菌菌落,但顯微鏡觀察卻發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞形體很大且不能被革蘭氏染色法染色。處于芽孢態(tài)菌體。4)經(jīng)分離純化所獲得的另一株菌的單個(gè)菌落在顯微鏡下可觀察到不同形態(tài)的菌體,有圓球狀,二鏈球狀,鏈球狀及菌絲體狀。其分類學(xué)鑒定尚需深入的研究。向廷生,汪保衛(wèi),油田地表土壤甲烷氧化菌的分離鑒定及活性測(cè)定,石油天然氣學(xué)報(bào)(江漢石油學(xué)院學(xué)報(bào)),2005,4:324-328[摘要]對(duì)從遼河海河油田稠油區(qū)塊分離的能降解稠油的4株細(xì)菌與溫度、pH值、礦化度、地層水和原油的配伍性及模擬驅(qū)油特性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明,所優(yōu)選的4種細(xì)菌在70℃都能較好生長(zhǎng);能生長(zhǎng)的pH值范圍為510～1110;一般在礦化度為8%～12%時(shí)均能生長(zhǎng);配伍性都很好。模擬試驗(yàn)表明,4種單一菌及混合菌種均能不同程度地提高稠油采收率。微生物提高原油采收率,是將選擇的微生物注入油層,隨之它們?cè)谟筒貎?nèi)生存、代謝、增殖和運(yùn)移,這些將有助于進(jìn)一步降低在二次采油方法開采后留在油藏中的殘余油。已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)菌對(duì)稠油有很好的降粘能力,表明微生物提高稠油采收率技術(shù)有巨大潛在應(yīng)用價(jià)值。目前人們正在把這種技術(shù)應(yīng)用于難以開采的稠油。然而由于地層條件常常限制微生物的生存,因此,在進(jìn)入現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用之前,必須充分研究油油的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)微生物的生存、繁殖和代謝活動(dòng)的影響。本實(shí)驗(yàn)中所用油樣分別取自遼河海河稠油區(qū)塊、江漢王新斜3井和南陽(yáng)井樓稠油區(qū)塊。菌種是取遼河油水樣通過富集分離培養(yǎng)的,有4株單一菌和1株混合菌共5個(gè)菌種。實(shí)驗(yàn)主要考查細(xì)菌在油層狀況下的生長(zhǎng)與對(duì)稠油的降粘能力。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)M：首先測(cè)試巖芯的特性參數(shù),然后對(duì)原油飽和巖心用10%的NaCl溶液進(jìn)行驅(qū)替,直到?jīng)]有油驅(qū)出為止,測(cè)量驅(qū)出原油的體積;然后向巖心中注入菌液,注完后將巖心從夾持器中取出,置于50℃實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1)實(shí)驗(yàn)所用的菌種的溫度范圍為40～60℃,在702)實(shí)驗(yàn)菌種可在礦化度為8%～12%的范圍內(nèi)生長(zhǎng),其中1號(hào)菌在礦化度為14%時(shí)也能生長(zhǎng)。3)實(shí)驗(yàn)菌種生長(zhǎng)適應(yīng)的pH值范圍較廣,為510～1110,最適宜的pH值為810。4)實(shí)驗(yàn)菌種與供實(shí)驗(yàn)用的遼河、江漢、南陽(yáng)油田地層水與油的配伍性均好。5)試驗(yàn)菌種能提高稠油采收率,且混合菌比單一菌的增產(chǎn)率要高。這些菌種對(duì)于遼河、江漢、南陽(yáng)等油田的稠油開采有較好的應(yīng)用前景。何正國(guó)，曾凡剛，向廷生等，提高稠油采收率的微生物菌種實(shí)驗(yàn)研究，江漢石油學(xué)院學(xué)報(bào)2001年9月第23卷增刊，121-122摘要:通過分析港西油田北3區(qū)塊油藏物理化學(xué)條件、地層水中微生物種群的組成、硫酸鹽還原作用和產(chǎn)甲烷作用的速率,以研究該區(qū)塊采用本源微生物驅(qū)油的潛力。結(jié)果表明,港西油田北3區(qū)塊含有多種微生物群落,包括產(chǎn)生表面活性劑的烴氧化菌,利用糖產(chǎn)生氣體、酸、溶劑和生物聚合物的厭氧發(fā)酵菌和產(chǎn)生甲烷的產(chǎn)甲烷菌。通過本源菌作用原油前后的紅外光譜結(jié)果分析,原油中芳烴結(jié)構(gòu)變化明顯。綜合微生物學(xué)、油藏條件研究結(jié)果,通過激活地層烴氧化菌、發(fā)酵菌和產(chǎn)甲烷菌的本源微生物驅(qū)提高原油采收率技術(shù)在該區(qū)塊是可行的。向廷生,佘躍惠,N.T.Nazina等，港西油田北3區(qū)塊本源微生物驅(qū)油潛力研究，河南石油，2005，19(5)：33-35摘要:本源微生物采油不存在菌種適應(yīng)性、變異退化等問題,減少了菌種的發(fā)酵、注入等操作程序,工藝簡(jiǎn)單、投資少、成本低。應(yīng)用本源微生物驅(qū)油技術(shù)可以改善油藏條件,提高原油最終采收率。2001～2004年,在大港孔店油田北區(qū)塊應(yīng)用了營(yíng)養(yǎng)物水驅(qū)生物技術(shù)。根據(jù)油藏地質(zhì)和工程、開發(fā)狀況及生化參數(shù)分析結(jié)果,確定了注入混氣營(yíng)養(yǎng)物激活本源微生物生長(zhǎng)來提高采收率試驗(yàn)方案。對(duì)流體的理化參數(shù)監(jiān)測(cè)以及生產(chǎn)動(dòng)態(tài)跟蹤和評(píng)價(jià)結(jié)果表明,試驗(yàn)是成功的,油藏生態(tài)環(huán)境發(fā)生明顯變化,流體性質(zhì)明顯改善?，F(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)期間,累計(jì)增油17866t。20世紀(jì)50年代,俄羅斯科學(xué)院微生物研究所以地質(zhì)微生物學(xué)為基礎(chǔ),利用長(zhǎng)期注水開發(fā)油田中帶入地層的細(xì)菌,率先開展本源微生物提高石油采收率的研究工作。通過20多年的深入研究,于80年代在俄羅斯4個(gè)油田的26個(gè)區(qū)塊進(jìn)行礦場(chǎng)試驗(yàn),取得了增油55×104t的明顯效果,積累了大量的室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和礦場(chǎng)試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn),使該項(xiàng)技術(shù)成為一項(xiàng)成熟的提高采收率技術(shù)[1～4]。在利用現(xiàn)有工藝技術(shù)進(jìn)行一次、二次、三次采油之后,還有40%～60%的原油滯留在油藏中未采出。微生物采油(MEOR)是一種成本低廉的開采剩余油的有效途徑,近10a來在國(guó)內(nèi)外發(fā)展很快[5～7]。據(jù)統(tǒng)計(jì),俄羅斯采用聚合物驅(qū)油,增產(chǎn)1t原油的額外成本是30美元,而用本源微生物技術(shù)采油,增產(chǎn)1t原油的額外成本是5～10美元;我國(guó)大慶油田三次采油增產(chǎn)1t原油的額外成本約為200～300元,由此可知本源微生物驅(qū)(MEOR)在成本上的優(yōu)勢(shì)。本源微生物提高采收率(MEOR)工藝對(duì)油藏環(huán)境無二次污染,對(duì)人體健康和環(huán)境無毒害,是一種綠色環(huán)保的工藝技術(shù)。在全球能源日益緊張的今天,特別是能源嚴(yán)重短缺的中國(guó),開展本源微生物驅(qū)(ME2OR),對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)意義重大。初步篩選出適合本源菌驅(qū)油條件的3個(gè)區(qū)塊,優(yōu)選出具有一定試驗(yàn)規(guī)模、油層相對(duì)單一、儲(chǔ)層條件較好的孔二北斷塊為先導(dǎo)試驗(yàn)區(qū)。對(duì)該油田先導(dǎo)試驗(yàn)區(qū)地層流體的取樣分析認(rèn)為,試驗(yàn)區(qū)具有很大的提高采收率潛力,可以采用生物技術(shù)提高原油采收率。根據(jù)油藏地質(zhì)和工程、開發(fā)狀況及生化參數(shù)分析結(jié)果,確定了注入混氣營(yíng)養(yǎng)物的激活本源菌來提高采收率的試驗(yàn)方案。(1)微生物活性導(dǎo)致原油氧化和生態(tài)系統(tǒng)物理化學(xué)特性的改變,水中可溶性碳酸鹽的濃度從014～016gPL增加到017～1183gPL(1094-1、1017-7、1008-1、1050-3井),在1017-2井中其濃度達(dá)到1183gPL。(2)生物激活處理前,地層水中乙酸鹽的濃度小于5mgPL,而生物激活處理后,低分子脂肪酸鹽最大濃度超過了150mgPL(1008-1、1017-5、1017-3、1002-1、1015-1、1094-1井)。(3)由于生物技術(shù)的應(yīng)用,孔店油田23口生產(chǎn)井的4口井(1017-7、1008-1、1017-2、1094-1井)的產(chǎn)出液中原油產(chǎn)量增加,含水量減少,數(shù)口井(1015-1、1094、1032,1032-1、1012、63、1017-5、1050-3及其它井)的原油產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。流體性質(zhì)監(jiān)測(cè)以及生產(chǎn)動(dòng)態(tài)跟蹤和評(píng)價(jià)結(jié)果表明,試驗(yàn)是成功的,油藏生態(tài)環(huán)境發(fā)生明顯變化,流體性質(zhì)明顯改善,截至2005年生明顯變化,流體性質(zhì)明顯改善,截至2005年2月,累計(jì)增油17866t。向廷生,馮慶賢,佘躍惠等，本源微生物驅(qū)在大港高溫稠油油田的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，特種油氣藏，2005，12(5)：72-75摘要:總結(jié)了地質(zhì)微生物技術(shù)包括油氣微生物勘探技術(shù)(MPOG)和本源微生物采油技術(shù)(MEOR)的理論基礎(chǔ)和原理,簡(jiǎn)述了MPOG和MEOR技術(shù)的流程和主要特點(diǎn)等,評(píng)述了MPOG和MEOR技術(shù)在石油天然氣勘探開發(fā)中的應(yīng)用現(xiàn)狀。MPOG和MEOR技術(shù)的應(yīng)用實(shí)踐表明,加強(qiáng)基礎(chǔ)理論研究,培養(yǎng)和造就一批擁有微生物學(xué)、生物化學(xué)、地球化學(xué)、石油地質(zhì)學(xué)和石油工程學(xué)等多學(xué)科理論和技術(shù)的專門人才或者實(shí)現(xiàn)了這些相關(guān)學(xué)科人才的有效結(jié)合,發(fā)展中國(guó)自己的成套地質(zhì)生物技術(shù),必將對(duì)大幅度提高我國(guó)油氣勘探成功率和采收率產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。20世紀(jì)后期,現(xiàn)代生物技術(shù)飛速發(fā)展,越來越廣泛地滲透到科學(xué)和經(jīng)濟(jì)的各個(gè)領(lǐng)域,推動(dòng)著社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展和人們生活質(zhì)量的提高。在新的世紀(jì)里,這種發(fā)展趨勢(shì)更加明顯地展現(xiàn)在人們面前。石油和天然氣工業(yè)是國(guó)家重要的基礎(chǔ)能源工業(yè),其上游工程——石油和天然氣勘探開發(fā)當(dāng)前面臨新的形勢(shì)和發(fā)展機(jī)遇,提高石油和天然氣勘探開發(fā)的效益已成為緊迫的任務(wù),而研發(fā)和應(yīng)用廉價(jià)而有效的生物技術(shù)是完成這一任務(wù)的一種新的技術(shù)手段。近20年來,我國(guó)科學(xué)和工業(yè)界在研究和引進(jìn)微生物采油技術(shù)(MEOR)方面取得了較好效果。在中斷了30多年之后,我國(guó)的微生物勘探技術(shù)(MPOG)研究又重新邁開了步伐,以往的實(shí)踐為今后的發(fā)展打下了基礎(chǔ)。然而,生物技術(shù)在石油天然氣勘探開發(fā)中的應(yīng)用遠(yuǎn)未達(dá)到石油工業(yè)所期望的規(guī)模效益。在油氣勘探開發(fā)中生物技術(shù)的研究對(duì)象是地下生物圈中的地質(zhì)微生物,包括地下淺層的土壤微生物和地下深層油氣藏中的極端微生物。研究這類微生物的多樣性、生態(tài)環(huán)境、基因構(gòu)成、代謝特性、地球化學(xué)過程與產(chǎn)物,利用土壤中烴氧化菌異常預(yù)測(cè)下伏油氣藏,通過人工激活本源微生物的地球化學(xué)活性實(shí)現(xiàn)井間驅(qū)替來提高石油采收率等與地質(zhì)環(huán)境下微生物地球化學(xué)作用緊密相關(guān)的生物技術(shù)稱之為地質(zhì)微生物技術(shù)(Geo-biotechnology)。該技術(shù)具有明顯的多學(xué)科性質(zhì)或交叉學(xué)科性質(zhì)。只有造就了一批擁有微生物學(xué)、生物化學(xué)、地球化學(xué)、石油地質(zhì)學(xué)和石油工程學(xué)等多學(xué)科理論和技術(shù)的專門人才或者實(shí)現(xiàn)了這些相關(guān)學(xué)科人才的有效結(jié)合,才可能創(chuàng)造出中國(guó)自己的成套地質(zhì)生物技術(shù),才能為提高我國(guó)石油天然氣勘探開發(fā)的規(guī)模效益做出卓有成效的貢獻(xiàn)。本文試圖對(duì)地質(zhì)微生物技術(shù)在石油天然氣勘探開發(fā)中的應(yīng)用現(xiàn)狀加以評(píng)述。梅博文,袁志華，地質(zhì)微生物技術(shù)在油氣勘探開發(fā)中的應(yīng)用，天然氣地球科學(xué)，2004,15(2)：156-160何正國(guó)，向廷生，梅博文等，微生物提高稠油采收率室內(nèi)研究，石油鉆采工藝，1999,21（3）：95－101[摘要]采用細(xì)菌通用引物和古細(xì)菌引物對(duì)青海七個(gè)泉油田本源微生物樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)基因庫(kù)進(jìn)行克隆和DNA序列分析,將測(cè)序結(jié)果通過與基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明七個(gè)泉油田樣品中有大量海桿菌屬和甲胞菌屬,樣品中還發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)甲烷古菌及一些不可培養(yǎng)的其它古菌類群。它們的分離方法、功能和生長(zhǎng)代謝特性有待于深入研究,以便篩選用于提高該油田原油采收率的采油功能菌群。[關(guān)鍵詞]七個(gè)泉油田;本源微生物;基因文庫(kù);多樣性111材料所用材料包括:取自青海七個(gè)泉油田七324油井井口油水樣;試劑和儀器有酵母膏(YeastEx2tract)、蛋白胨(Typtone)、瓊脂糖(Agrose)、DNA聚合酶和10′Buffer(博采公司)、V2geneDNA純化試劑盒、PEMG2Teasyvector連接試劑盒(Promaga)、PCR儀、4℃水浴鍋及凝膠成像UV系統(tǒng)。16SrRNA基因PCR擴(kuò)增引物[1,2]:細(xì)菌:F:52A佘躍惠,舒福昌，何正國(guó)等，青海七個(gè)泉油田本源微生物區(qū)系初步調(diào)查,石油天然氣學(xué)報(bào)(江漢石油學(xué)院學(xué)報(bào)),2005,27:5摘要:在二連盆地馬尼特坳陷哈日嘎構(gòu)造進(jìn)行油氣微生物勘探,微生物勘探測(cè)網(wǎng)為750m×750m,由德國(guó)MicroPro實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物分析并界定異常范圍。根據(jù)微生物識(shí)別出的石油異常分布可劃分出3個(gè)明顯的含油前景區(qū),試驗(yàn)區(qū)僅2口探井,相對(duì)于現(xiàn)有的2口井而言,微生物油氣勘探的符合率為100%,其效果是理想的。圖3表1參2(袁志華摘)關(guān)鍵詞:油氣微生物勘探;烴氧化菌;油顯示油氣微生物勘探(MPOG)技術(shù)是一種新的地表油氣勘探方法,可以預(yù)測(cè)非常規(guī)油氣藏和深部油氣藏,確定圈閉的含油氣級(jí)別和油氣分布,指明油氣藏泄油氣位置,具有直接、有效、多解性小而經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì),日益受到全球油氣勘探界的重視[1,2]。本文就二連盆地馬尼特坳陷哈日嘎構(gòu)造進(jìn)行的油氣微生物勘探情況和效果進(jìn)行簡(jiǎn)介。袁志華,梅博文,佘躍惠,二連盆地馬尼特坳陷油氣微生物勘探,石油勘探與開發(fā),2002,29(6):64-65摘要:在好氧及厭氧實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn),烴氧化菌和硫酸鹽還原菌(SRB)的混合菌可以直接消耗原油,使原油的組分發(fā)生變化。對(duì)經(jīng)微生物處理后的原油進(jìn)行了氣相色譜分析,結(jié)果表明:烴氧化菌可以降解原油,使輕組分相對(duì)減少、重組分相對(duì)增加;硫酸鹽還原菌在厭氧條件下也可以降解原油,但與前者的結(jié)果是有差別的。在塔里木盆地一些油氣藏的地層水中檢測(cè)到的硫酸鹽還原菌的含量高達(dá)104個(gè)/ml.支持了這些油氣藏中的H2S為生物成因的觀點(diǎn)。沉積物中的有機(jī)質(zhì)可因生物、化學(xué)、熱等因素而發(fā)生變化。其中,微生物硫酸鹽還原作用被認(rèn)為是自然界中一種重要的使有機(jī)質(zhì)發(fā)生蝕變的作用。大量的地質(zhì)實(shí)例顯示,油氣儲(chǔ)層附近常含有高的H2S氣體或黃鐵礦、蝕變的烴類和由輕同位素組成的CO2氣體或方解石膠結(jié)物[1]。對(duì)于這種觀察結(jié)果的解釋一般是根據(jù)純種的SRB所作的實(shí)驗(yàn)而得出的:SRB只能發(fā)生在低于80℃溫度和間接利用好氧微生物對(duì)烴類的代謝產(chǎn)物——油藏中的硫化氫的化學(xué)來源有如下兩種途徑。一種是有機(jī)原油組分作為還原劑的化學(xué)硫酸鹽還原作用。該作用需要在120℃溫度下進(jìn)行,反應(yīng)中間產(chǎn)物可能是來自含氧硫化物的元素硫。另一種化學(xué)來源可能是原油中有機(jī)硫化物的裂解。細(xì)菌硫酸鹽還原作用可產(chǎn)生高的分餾效應(yīng),一般在60℃以下進(jìn)行。近年來在生產(chǎn)流體中發(fā)現(xiàn)了極端嗜熱硫酸鹽還原菌,油藏溫度可達(dá)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示的混合菌屬的硫酸鹽還原菌能夠直接利用原油,改變了人們對(duì)硫酸鹽還原菌只能消耗好氧微生物降解烴類的副產(chǎn)物——有機(jī)酸的傳統(tǒng)觀念,對(duì)許多地質(zhì)現(xiàn)象有可能需要重新解釋。同時(shí),這也意味著,如果硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)和繁殖所能依賴的溫度、鹽度和SO2-4含量等條件滿足的話,在中—淺埋深的油氣藏中仍能發(fā)生烴類的降解作用。硫酸鹽還原菌對(duì)各油藏成熟早期烴的消耗也起著一定的作用[5～11]。油氣藏中微生物的降解作用不僅僅局限在含氧的環(huán)境。向廷生,萬家云,蔡春芳,硫酸鹽還原菌對(duì)原油的降解作用和硫化氫的生成,天然氣地球科學(xué),2004,15(2):171-173摘要:從青海油田地層水中分離培養(yǎng)出4株微生物菌種,對(duì)其進(jìn)行了耐溫性、耐鹽性等進(jìn)行了探討,分析了微生物處理前后原油組份及物性變化情況,并采用巖芯流動(dòng)試驗(yàn)探討了微生物的驅(qū)油效果。結(jié)果表明,這幾種微生物菌種均能適應(yīng)青海油田溫度及高礦化度地層環(huán)境,作用于原油后對(duì)原油中的長(zhǎng)鏈飽和烴類物質(zhì)有較好的降解作用,能使其分子鏈變短,并產(chǎn)生有機(jī)酸或石油羧酸鹽類表面活性劑等低分子物質(zhì),使原油的粘度、凝點(diǎn)及蠟含量均出現(xiàn)明顯的下降,改善原油的流動(dòng)性能,提高石油采收率。2口井的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)證明,微生物采油具有良好的提高石油采收率的效果和清蠟減阻效果。微生物提高石油采收率(MicrobialEnhancedOilRecovery,簡(jiǎn)稱MEOR)技術(shù)自20世紀(jì)30年代提出,已逐步引起世界各國(guó)的科學(xué)家的重視,其研究與應(yīng)用取得了很大的進(jìn)展,MEOR已被認(rèn)為是最有前途的一種提高石油采收率的方法[1-3]。我國(guó)從20世紀(jì)60年代開始MEOR技術(shù)研究,到90年代已相繼在大慶、勝利、新疆、遼河、大港、吉林、華北等油田開展了現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn),取得了良好的增產(chǎn)效果[4]。1.2.1原油降解試驗(yàn)以青海油田7個(gè)泉油田19井原油為試驗(yàn)油樣。先在200ml液體培養(yǎng)基中加入油樣,再分別加入上述從青海油田水體上述篩選的單一菌種液或混合菌種液,充分搖勻后置于生化培養(yǎng)箱中在50℃1.2.2微生物處理前后原油組份及物性分析試驗(yàn)中用HP5800型氣相色譜儀(美國(guó)產(chǎn))和BrukerIFS型付里葉變換紅外光譜儀測(cè)定微生物處理前后各組份分子結(jié)構(gòu)的變化,用毛細(xì)管的等速電泳儀處理后的原油中的有機(jī)酸類物質(zhì)的含量,用BrookfieldDV-Ⅱ型流變儀(美國(guó)產(chǎn))對(duì)原油處理前后的粘度進(jìn)行測(cè)定(測(cè)定溫度為40℃1.2.3微生物驅(qū)油室內(nèi)模擬試驗(yàn)在室內(nèi),用填砂管巖芯試驗(yàn)儀進(jìn)行了微生物采油模擬實(shí)驗(yàn)。方法是先填制一定滲透率的人造砂管巖芯,用模擬青海油田地層水測(cè)水相滲透率Kw,然后向巖芯中擠入并飽和青海油田原油,用模擬地層水進(jìn)行驅(qū)油試驗(yàn),直至沒有原油流出為止,記錄水驅(qū)油的采收率;再向巖芯擠入1.0～2.0PV的菌液,將巖芯取出,置于滅過菌的培養(yǎng)基中,在生化培養(yǎng)箱中50℃4結(jié)論(1)微生物對(duì)原油中的長(zhǎng)鏈飽和烴類物質(zhì)有較好的降解作用,能使其分子鏈變短,并降低原油粘度。(2)原油經(jīng)微生物作用后會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸或石油羧酸鹽類表面活性劑等低分子物質(zhì),降低油水界面張力,啟動(dòng)剩余油的產(chǎn)出,提高石油采收率。(3)微生物作用后原油的粘度、凝點(diǎn)及蠟含量均出現(xiàn)明顯的下降,有利于改善原油的流動(dòng)性能,增加原油的產(chǎn)量。(4)青海油田2口井的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)證明,微生物采油具有良好的提高石油采收率的效果和清蠟減阻效果。周玲革,向廷生,佘躍惠,青海油田微生物采油技術(shù)研究,生物技術(shù),2004,14(6):58-59摘要本研究對(duì)遼河、江漢油水樣中分離的4株微生物K在青海七個(gè)泉油田中19井微生物增油的機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的研究和分析L結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種微生物能不同程度降解原油長(zhǎng)鏈烷烴和芳烴且混合菌較單一菌效果好K同時(shí)生成大量具有降粘能力的短鏈有機(jī)酸、醇和生物氣等物質(zhì)L模擬試驗(yàn)表明K4種微生物及混合菌種均能不同程度地提高原油采收率。自1926年美國(guó)人Beckman提出細(xì)菌采油的想法以來K微生物提高原油采收率技術(shù)經(jīng)歷幾十年的研究和應(yīng)用已經(jīng)有了較大進(jìn)展。90年代微生物采油技術(shù)在羅馬尼亞、前蘇聯(lián)、美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)的礦場(chǎng)成功試驗(yàn)K標(biāo)志其工業(yè)應(yīng)用階段已經(jīng)到來。目前K微生物驅(qū)油已成為油田現(xiàn)場(chǎng)工業(yè)應(yīng)用中新的提高采收率方法。我國(guó)自60年代開始研究微生物采油技術(shù)。繼70年代大慶油田開展微生物吞吐礦場(chǎng)試驗(yàn)之后，吉林油田、大港油田、大慶油田也相繼進(jìn)行了試驗(yàn)并取得了較好效果。近一二年來，大慶、勝利、遼河、吉林、大港等油田都開展了規(guī)模較大的礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。然而由于種種原因K礦場(chǎng)試驗(yàn)的規(guī)模與采油機(jī)理研究很不協(xié)調(diào)K機(jī)理研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于現(xiàn)場(chǎng)K使礦場(chǎng)試驗(yàn)存在較大的盲目性。因此K為了使我國(guó)微生物采油研究和應(yīng)用步入?yún)f(xié)調(diào)發(fā)展軌道，采油機(jī)理研究亟待加強(qiáng)。通過以上幾個(gè)方面的研究和分析，可得出以下結(jié)論：1.微生物可降解長(zhǎng)鏈飽和烴為中短鏈烴，使飽和烴平均分子鏈長(zhǎng)變短，降低原油粘度。2.微生物可作用芳烴和膠質(zhì)，產(chǎn)生長(zhǎng)鏈分子脂肪酸及含羰基化合物等生物表面活性劑作用的物質(zhì)。3.微生物降解原油能產(chǎn)生短鏈分子有機(jī)酸和醇類物質(zhì)，能增加巖石孔隙度和改善原油粘度。4.微生物作用原油能夠產(chǎn)生短鏈烷烴氣和二氧化碳等，有利于增加產(chǎn)層壓力。以上幾點(diǎn)都是微生物增油的機(jī)理。何正國(guó),向廷生,梅博文,微生物采油機(jī)理研究,鉆采工藝,1999,22(1):19-21摘要微生物提高石油采收率(MEOR)是一種新型的三次采油技術(shù)(EOR).本文介紹了MEOR的研究概況,分析了MEOR的機(jī)理,闡述了MEOR的地質(zhì)基礎(chǔ)及油井篩選標(biāo)準(zhǔn)和微生物的類型,同時(shí)還提出了MEOR的工藝類型和研究方法,為開展MEOR研究提供了很好的指導(dǎo)作用.當(dāng)今從地下油藏開發(fā)石油所采用的工藝技術(shù)(一次采油和二次采油)只能采出原始地質(zhì)儲(chǔ)量的30%～50%[1],如何采出油藏中一半以上的殘余油是科技工作者十分關(guān)心的問題.由此,逐步發(fā)展和形成了三次采油技術(shù)———又稱強(qiáng)化采油技術(shù)(EnhancedOilRecoveryTechnology簡(jiǎn)稱EOR).微生物提高石油采收率(MicrobialEnhancedOilRecoveryTechnology簡(jiǎn)稱MEOR)技術(shù)作為一種新型的EOR方法,從本世紀(jì)30年代提出,直到80年代中期,才引起科技界的廣泛興趣,MEOR的研究與應(yīng)用取得了很大的進(jìn)展.從理論上來講,厭氧菌比好氧菌更適于用來提高石油產(chǎn)率.4.2固有微生物和注入微生物[10]由于營(yíng)養(yǎng)缺乏,油井中固有的各種微生物的生長(zhǎng)繁殖受到一定限制,為了發(fā)揮固有微生物的作用,可向井中注入微生物培養(yǎng)基促進(jìn)微生物的生長(zhǎng),通過固有微生物的作用提高開采率.油井中固有微生物的種類有限,而可供選擇的注入微生物的種類卻很多.注入微生物還可以在地面上培養(yǎng)到有充足的生物量后,再注入井中,這樣,能更快地發(fā)揮作用,減少封井的時(shí)間,但注入微生物在井下可能會(huì)受到油井條件的制約而降低作用甚至失去作用[9].周玲革,張巧玲,微生物提高石油采收率技術(shù),荊州師專學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999,22(2):78-81摘要：油藏是一種特殊環(huán)境，其高溫、高壓、高礦化度、無氧、多孔介質(zhì)及其流體等因素對(duì)微生物的存活及生長(zhǎng)繁殖都會(huì)產(chǎn)生明顯影響。油藏極端環(huán)境對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成和數(shù)量也會(huì)有大的影響。該文介紹了與微生物采油關(guān)系緊密的微生物群落的生理生化特征及其多樣性。主要有烴降解菌、發(fā)酵菌、硫酸鹽還原菌及產(chǎn)甲烷菌。還介紹了激活本源微生物和篩選外源微生物在提高石油采收率方面的應(yīng)用。最后就分子生物技術(shù)在研究油藏中可培養(yǎng)微生物和未培養(yǎng)微生物中的應(yīng)用進(jìn)行了討論。微生物在油藏中生存或生長(zhǎng)取決于生態(tài)系統(tǒng)中物理特性化學(xué)特性。不同類型的油藏構(gòu)成了復(fù)雜多樣的生態(tài)環(huán)境。油藏的溫度一般在30～140℃，壓力從幾兆帕到數(shù)十兆帕，礦化度從淡水到含鹽20%以上。油藏基質(zhì)為結(jié)構(gòu)尺寸變化多樣的孔隙介質(zhì)，孔隙介質(zhì)中充滿著油、氣和水，隨沉積環(huán)境不同，油、氣、水性質(zhì)差別很大。油藏在開發(fā)之前為封閉系統(tǒng)，油藏為一高度還原環(huán)境，主要存在厭氧微生物；在開發(fā)之后的注水階段變?yōu)殚_放系統(tǒng),注入的水將溶解氧和生活在地表的微生物不斷地帶入地層。在注水井及近井地帶存在一定范圍地有氧環(huán)境,沿注水井向油藏深部至采油井方向溶解氧含量降低。油田經(jīng)長(zhǎng)期注水開發(fā),地層中已形成了較為穩(wěn)定地微生物群落。這些微生物主要包括石油降解菌、發(fā)酵菌、產(chǎn)甲烷菌、硫酸鹽還原菌、鐵細(xì)菌及硝酸鹽還原菌等。由于油田水中含有的氮、磷很低,油藏中的微生物數(shù)量一般較低。在微生物采油技術(shù)研究中,對(duì)選定區(qū)塊地層水中微生物群落進(jìn)行分析,從外源微生物采油技術(shù)角度是為了考察注入的優(yōu)勢(shì)菌與地層本源菌的配伍情況,從本源微生物驅(qū)油技術(shù)角度,這是為了選擇性激活地層中有益的本源菌,抑制有害的本源菌。通過研究油藏微生物菌落結(jié)構(gòu)及其數(shù)量對(duì)采用微生物技術(shù)提高原油采收率具有重要意義。由于油藏的環(huán)境極其多樣,這些微生物的種類也非常多樣,研究油藏中的微生物群落對(duì)于獲得微生物功能基因和開發(fā)新的生物制品有重要意義。由于油藏的環(huán)境極其多樣,這些微生物的種類也非常多樣,研究油藏中的微生物群落對(duì)于獲得微生物功能基因和開發(fā)新的生物制品有重要意義。1油藏中的微生物生理群1.1烴降解菌石油烴降解菌是指可以利用石油烴作為生長(zhǎng)底物的菌群。這類細(xì)菌在注水井及近井地帶最為豐富,是注水地層中微生物食物鏈的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。烴降解菌可以通過自身的代謝作用產(chǎn)生分解酶,裂解重質(zhì)烴類和石蠟,降低原油粘度,改善原油的流動(dòng)性能。烴降解菌還可代謝產(chǎn)生表面活性劑、聚合物、有機(jī)酸、醇類和二氧化碳等有利于驅(qū)油的產(chǎn)物。石油烴降解菌大部分為好氧菌,即烴氧化菌。代表性菌株有微球菌(Micrococcus)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、紅球菌(Rhodococcus)和鹽桿菌(Halobacterium)等[2]。NazinaT.N等[3]從Kazakhstan和WestSiberia油田分離到嗜熱的烴氧化菌。菌株桿狀、運(yùn)動(dòng),內(nèi)生芽孢,嚴(yán)格好氧,生長(zhǎng)溫度為40～70℃。最適生長(zhǎng)條件:pH,6～8,溫度55～60℃,NaCl濃度5～10gPL。該菌鑒定為嗜熱嗜油芽孢桿菌(B.thermoleovorans)。1.2發(fā)酵菌嗜溫、嗜熱和極端嗜熱發(fā)酵菌構(gòu)成了油藏環(huán)境的一個(gè)重要微生物群落。從油田水中分離出的具有嗜鹽特性的厭氧微生物主要屬于鹽厭氧菌屬(Haloanaerobium),包括乙酰乙基擬鹽桿菌(H.acetoethlicum),H.congolense及油田水鹽厭氧菌(H.salsugo)。這三種菌中度嗜鹽,最佳生長(zhǎng)鹽濃度為10%NaCl。H.congolense在底物利用范圍上不同于其他兩種,它利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸而不產(chǎn)乙醇[4,5]。從非洲剛果的一個(gè)油田分離出一種中度嗜鹽螺旋體(SpirochaetaSmaradinae)[6]。此外還在該油田分離到低嗜鹽弧菌(Dethiosulfovibriopep2tidovorans)。其物理和生長(zhǎng)發(fā)育特征獨(dú)特,可以利用蛋白胨和氨基酸,但不能發(fā)酵糖類。Davydova-Charakhch’yanIA,etal.[7]從Tatarriawest和Siberia油田地層水中分離到一新的產(chǎn)乙酸厭氧微生物(Acetoanaerobiumromashkovii)。這種菌以H2+CO2為唯一碳源和能源生長(zhǎng)。也可以利用C1化合物,氨基酸和糖。由于大多數(shù)油田具有高溫特征,分離到的嗜熱發(fā)酵菌比嗜溫發(fā)酵菌要多得多。一般嗜熱厭氧菌研究也較廣泛,主要是其熱穩(wěn)定酶的工業(yè)潛力。從103℃的熱油田中分離到極端嗜熱微生物,人們對(duì)此越來越感興趣。許多作者從油田中分離到棲熱袍菌屬(Thermotoga)微生物[8,9]。如:Thermotogaelfii、Thermotogasubterranean和Thermotogahypogea。從熱的低鹽度的油藏中經(jīng)常會(huì)分離到熱厭氧桿菌屬微生物。從法國(guó)一熱的陸相油藏中分離到一株熱硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)。最近的研究提供了熱的陸相和海相油藏中極端嗜熱發(fā)酵嗜熱古細(xì)菌的證據(jù)[10]。在DNAPDNA雜交研究基礎(chǔ)上,鑒定出菌株1、2(Thermococcusceler、T.littoralis)屬于熱球菌屬(Thermococcus),在溫度85℃時(shí)生長(zhǎng);菌株3(P.litho2trophicus)屬于火球菌屬(Pyrococcus)的一個(gè)新種,生長(zhǎng)溫度達(dá)到1.3硫酸鹽還原菌(SRB)油藏中硫酸鹽還原菌包括脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、脫硫腸菌屬(Desulfotomaculum)和脫硫狀菌屬(Desulfacinum)。在油田污水回注系統(tǒng)和油層缺氧環(huán)境中廣泛存在。SRB代謝產(chǎn)生H2S酸性氣體,不但可以提高地層壓力,還可以溶解碳酸鹽巖層,促進(jìn)原油的釋放和增大地層的滲透率。某些菌種還可以降解石油中的組分,改善原油的流動(dòng)性,提高原油采收率。但這類菌群的活動(dòng)使產(chǎn)出的油氣中含有硫化氫,增加生產(chǎn)設(shè)施的腐蝕問題,并帶來嚴(yán)重的生產(chǎn)安全問題。因?yàn)槠溆泻π?SRB是油田水中研究得最詳細(xì)的細(xì)菌群落。1.3.1嗜溫硫酸鹽還原菌油田水中最常被分離出的SRB屬于脫硫弧菌屬。Desul2fvibrio.longus和D.vietnamensis被認(rèn)為是耐鹽的。而D.ga2bonensis被認(rèn)為是中度嗜鹽,最佳生長(zhǎng)需5～6%NaCl。這三種菌是不完全氧化菌,使用氫氣、乳酸鹽和丙酮酸鹽作為底物。從Apsheron半島地層水中分離出耐鹽的脫硫微菌屬(Des2ulfomicrobium),耐鹽可達(dá)到8%NaCl,將乳酸不完全氧化為乙酸。它自氧生長(zhǎng),因此,很容易與上面提到的三種脫硫弧菌區(qū)分開。用寡核苷酸探針鑒定了在油田環(huán)境中脫硫細(xì)菌屬(Des2ulfobacter)的一些菌株[11]。1.3.2嗜熱硫酸鹽還原菌對(duì)于在油田環(huán)境中存在的脫硫腸菌屬(Desulfotomaculum)菌種已有詳細(xì)報(bào)道[12]。Desulfotomaculumkuznetsovii最初從地下熱礦泉水中分離到,隨后從巴黎盆地非水驅(qū)油田的井口樣品中分離到。從北海挪威海床下分離到Desulfotomaculumthermo2cisternum,最佳生長(zhǎng)溫度在62℃。它在硫酸鹽存在下,不完全氧化的底物范圍很廣,包括乳酸鹽、乙醇、丁醇和羧酸。從WesternSiberia油樣中分離到Desulfotomaculumnigrificans的亞種(D.nigrificanssubsp.salinus)[13]。生長(zhǎng)溫度40-70℃,不完全氧化乳酸鹽和乙醇。在北海Gullfaks油田盡管用富集培養(yǎng)方法沒有檢測(cè)到脫硫腸菌屬,但用專一性熒光抗體技術(shù)檢測(cè)到其存在[14]。另外一些嗜熱SRB從北海油藏中分離到[15],它們是:Desulfacinuminfernum,Thermodesulforhabdusnorvegicus(T.nor2vegicus)及Thermodesulfobacteriummobile(T.mobile)。與脫硫腸菌相反,D.infernum和T.norvegicus是完全氧化菌。D.infernum屬革蘭氏陰性菌,屬δ變形桿菌,可利用乙酸鹽、丁酸鹽、棕櫚酸鹽及乙醇,最佳生長(zhǎng)溫度為60℃。T.norvegicus也屬于δ在古生界,極端嗜熱微生物以古生球菌屬(Archaeoglobus)為代表。閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)從北海挪威熱油田水中分離到[16]。通過DNAPDNA雜交實(shí)驗(yàn),表明從油田水中分離的微生物同那些深海熱泉分離出的種群具有遺傳相似性。因此,可以推測(cè)它們的存在很可能由于海水進(jìn)入油藏或人類活動(dòng)帶來的污染。1.4產(chǎn)甲烷菌(Methanogenicbacteria)產(chǎn)甲烷菌為嚴(yán)格厭氧菌。從油層深部分離產(chǎn)甲烷菌直到最近才有報(bào)道。在低鹽度到高鹽度的中溫油藏中都有產(chǎn)甲烷菌存在。一般認(rèn)為高溫高鹽環(huán)境使得微生物群落急劇減少。Borzenkov等研究表明產(chǎn)甲烷菌隨鹽度增加而減少[17]。此外,甲胺的濃度(一種產(chǎn)甲烷底物)隨地層水礦化度增加而增加。嗜甲基菌Methanohalophiluseuhalobius從鹽度達(dá)140gPL的開發(fā)井樣品中分離出。從墨西哥海灣高地的一個(gè)油井中分離出MethanosarcinasiciliaeHI350[18]。該菌輕度嗜鹽,利用甲醇、甲胺和二甲基硫化物作底物。另一種利用甲醇和三甲基胺的中度嗜鹽產(chǎn)甲烷菌從含90gPLNaCl的法國(guó)Alsacian油田中分離。.1994-2006ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.除上述的球狀產(chǎn)甲烷菌外,桿狀菌嗜甲基產(chǎn)甲烷菌GF283從Bondyuzhskoe油田中分離出,最佳生長(zhǎng)鹽度為15%NaCl。在嗜溫和嗜熱油田水中,可以利用乙酸鹽富集培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌。分離到的一株嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌Methanosarcinamazei47可以利用乙酸鹽、甲醇和甲胺,但不能利用H2+CO2生長(zhǎng)[19]。北海油藏中的地層水在60℃、80℃、在油藏中除上述微生物外,還有鐵細(xì)菌、硫細(xì)菌、反消化細(xì)菌、產(chǎn)乙酸鹽菌等。此外,還有絕大多數(shù)的未培養(yǎng)微生物。這些微生物菌落對(duì)石油的生產(chǎn)都有一定的影響。2在石油工業(yè)中的應(yīng)用2.1激活本源微生物提高原油采收率本源微生物是指存在于油藏中較為穩(wěn)定的微生物群落,多數(shù)是在油田注水開發(fā)過程中由地表帶入且已適應(yīng)地層環(huán)境保存下來的微生物。由于地層缺乏微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),絕大多數(shù)處于休眠狀態(tài)。激活本源微生物提高原油采收率在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的一種方式是選擇性封堵(生物調(diào)剖)。VadieAA,etal.[20]在NorthBlow2hornCreek油田利用向地層水中加入硝酸鹽和磷酸鹽等無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),激活本源微生物進(jìn)行的選擇性封堵礦場(chǎng)試驗(yàn),有選擇性調(diào)整高滲透帶,使更多的注入水向低滲透帶流動(dòng),擴(kuò)大注入水的波及體積。菲利浦石油公司在激活和保持本源微生物活性方面申請(qǐng)了多項(xiàng)專利[21],這些專利都是關(guān)于如何注入地層缺乏而微生物又需要的營(yíng)養(yǎng)成分。該公司于1993年在俄克拉荷馬州NorthBurbank油田進(jìn)行了礦場(chǎng)試驗(yàn),目的是通過激活本源微生物的生長(zhǎng)而封堵高滲透層。注入井,關(guān)井2周后,經(jīng)檢測(cè)證實(shí)由于本源微生物的就地活動(dòng),有效滲透率下降了33%,形成了一個(gè)深部地層段塞。沙特阿拉伯Abdel-WhlyAA,etal.(1999)[22]利用重質(zhì)原油和原生水研究了本源微生物的生長(zhǎng)對(duì)水的粘度、pH值和油P水界面張力的影響。通過驅(qū)替實(shí)驗(yàn)研究了營(yíng)養(yǎng)物的濃度、培養(yǎng)溫度和碳酸鹽含量對(duì)水驅(qū)殘余油采收率的影響。結(jié)果表明:地層水和原油中的原生微生物群落能夠被營(yíng)養(yǎng)物糖蜜激活,產(chǎn)生生物表面活性劑、酸、聚合物和氣體;注入糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的營(yíng)養(yǎng)物段塞的效果最佳,本源微生物繁殖快,獲得的采收率高;在25℃俄羅斯從20世紀(jì)60年代就開始從事微生物采油技術(shù)的研究,并且進(jìn)行了大量的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn),尤其是近20年發(fā)展起來的本源微生物驅(qū)油技術(shù),己在現(xiàn)場(chǎng)見到了非常好的效果。俄羅斯科學(xué)院微生物研究所IvannnovMV,etal.[23]將油藏微生物生態(tài)學(xué)的研究成果應(yīng)用到石油開采上,提出好氧微生物-厭氧微生物交替降解石油的兩階段生物過程,并通過向油層通氣和加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)活化油層的微生物群,產(chǎn)生有利于驅(qū)油的物質(zhì),從而提高采收率。1993年至1994年,俄羅斯西伯利亞的Vyngapour油田用當(dāng)?shù)厥称芳庸U水中的細(xì)菌和注入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)激活地下原生細(xì)菌,進(jìn)行了本源微生物驅(qū)油礦場(chǎng)試驗(yàn),試驗(yàn)區(qū)塊地層溫度高達(dá)94℃2.2篩選優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)酵注入地層提高采收率菌種篩選是外源微生物采油技術(shù)的關(guān)鍵。篩選出的微生物要求不變異退化,適應(yīng)地層的環(huán)境,且無環(huán)境污染問題。針對(duì)油藏特點(diǎn),采油微生物還需具備如下特點(diǎn):1)能夠在油藏條件下旺盛地生長(zhǎng)繁殖。所選微生物必須適應(yīng)油藏地礦物巖性,油藏溫度,地層壓力,地層流體性質(zhì),包括原油性質(zhì)和地層水性質(zhì),如礦化度、pH值等。2)代謝產(chǎn)物有利于提高原油采收率。雖然微生物代謝產(chǎn)物十分復(fù)雜,但從提高采收率機(jī)理來看,代謝產(chǎn)物主要為:氣體、酸、有機(jī)溶劑、生物表面活性劑及生物聚合物等。3)能夠與地層本源菌配伍。篩選出的菌注入地層后應(yīng)成為優(yōu)勢(shì)菌,而不能受到地層本源菌的抑制。除了從自然界中廣泛篩選采油微生物外,還可以通過生物工程、遺傳工程和基因工程來構(gòu)建基因工程菌。將具有不同功能的菌的基因構(gòu)建到一個(gè)易生長(zhǎng)繁殖的生物載體上,得到采油用的超級(jí)菌。這種菌具有耐高溫、耐鹽的特性,還可以降解原油中的飽和烴、芳烴和膠質(zhì)瀝青質(zhì),代謝產(chǎn)物可以是生物表面活性劑、氣體、酸等。微生物采油的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外油田已取得明顯效果。1995年左右,美國(guó)NPC微生物公司、派克微生物公司等生產(chǎn)的微生物產(chǎn)品進(jìn)入我國(guó)油田市場(chǎng),先后在大港、遼河、勝利、大慶、新疆、吉林、華北等十幾個(gè)油田開展試驗(yàn),并逐漸由單井吞吐、清防蠟處理轉(zhuǎn)向微生物增效水驅(qū)。同時(shí),各油田開始建立MEOR實(shí)驗(yàn)室,從油田水中分離培養(yǎng)適合本油田的MEOR菌種[25]。3最新研究進(jìn)展3.1用分子生物技術(shù)對(duì)油藏中的微生物進(jìn)行分類鑒定隨著分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法的發(fā)展,人們運(yùn)用基于16rRNA(rDNA)基因的分子生物學(xué)來分析復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。近年來一些學(xué)者對(duì)油藏中微生物生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行了研究。VoordouwG,etal.[26]通過16SrRNA基因擴(kuò)增克隆測(cè)序研究了加拿大北部油田微生物群落的多樣性,檢測(cè)到多種革蘭氏陰性的SRB、厭氧菌、發(fā)酵菌和產(chǎn)醋酸菌。OrphanVJ,etal.[27]研究了加利福利亞高溫、富硫油藏微生物群落。從生產(chǎn)流體中全部菌落的DNA構(gòu)建了2個(gè)16SrRNA基因文庫(kù),使用古細(xì)菌或通用寡核苷酸引物。通用文庫(kù)系列分析表明克隆的大部分與從相似環(huán)境中分離得到的已知真細(xì)菌和古細(xì)菌高度類似。文庫(kù)中有代表性的屬有:熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerbacter),熱球菌屬(Thermococcus),脫硫弧菌屬(Desulfothiovibrio),氨基桿菌屬(Aminobacterium),氨基酸球菌屬(Acidaminococcus),假單胞菌屬(Pseudomonas),鹽單胞菌屬(Halomonas),不動(dòng)桿菌屬(Acine2tobacter),鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas),甲基桿菌屬(Methyl2obacterium)和脫硫微菌屬(Desulfomicrobium)。古細(xì)菌文庫(kù)與產(chǎn)甲烷菌類似的rDNAs占優(yōu)勢(shì),少量的克隆為熱球菌。FujiwaraK,etal.[28]利用限制性片斷長(zhǎng)度多樣性(RFLP)分析了向油藏注入的2種微生物(E.cloacaeTRC-322及B.licheniformisTRC-18-2-a)的16SrRNA基因,來監(jiān)測(cè)微生物在地層的繁殖和運(yùn)移情況。采集地層水和巖心樣,然后分離其中的微生物。通過利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增微生物的16SrRNA基因片斷。用RFLP方法分析16SrRNA基因,比較rRNA片斷,結(jié)果表明在RFLP圖中與E.cloacaeTRC322具有密切相關(guān)。而B.licheniformisTRC-18-2-a不在所分離的油藏樣品中。Jean2thonC,etal.[28]從法國(guó)東巴黎盆地油藏中分離到一株嗜熱、嚴(yán)格厭氧的微生物。通過16SrRNA序列分析該菌株屬于棲熱袍.1994-2006ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.菌屬。通過DNA-DNA雜交該菌株在種的水平上與海棲熱袍菌(T.maritima),那不勒斯棲熱袍菌(T.neapolitana)和溫泉棲熱袍菌(T.thermarum)沒有相似性。認(rèn)為是一株新種:地下棲熱袍菌(T.subterranea)。3.2利用分子生物技術(shù)研究油藏中未培養(yǎng)微生物群落一直以來許多科學(xué)工作者都在從事微生物提高原油采收率的研究,但這些研究都是集中在特殊生理菌群如硫酸鹽還原菌、產(chǎn)甲烷菌等可培養(yǎng)微生物上,研究表明可培養(yǎng)微生物僅占自然界微生物的0.1%～15%左右,石油儲(chǔ)層中也存在很多還沒有檢測(cè)到的微生物。由于石油儲(chǔ)層中可培養(yǎng)微生物與本源微生物多樣性之間的偏差,評(píng)價(jià)人工培養(yǎng)菌種在地層本源微生物群落中的地位是困難的。因此從事微生物采油研究首先必須弄清楚石油儲(chǔ)層中微生物群落的組成、各微生物種群的地位、整個(gè)采油過程中各微生物群落的變化以及它們之間的關(guān)系,從而發(fā)現(xiàn)與原油采收率相關(guān)的微生物菌群并將其應(yīng)用于微生物采油。因此,在微生物純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上來研究微生物提高原油采收率機(jī)理,并以此來指導(dǎo)微生物的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)還存在很大的不足。佘躍惠等[29,30]通過PCR-DGGE分子技術(shù)對(duì)新疆克拉瑪依油田地層水樣品進(jìn)行分析,揭示了該油藏中的微生物群落結(jié)構(gòu)。從分析的樣品中得到了很多新的基因序列,DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶序列分析表明為未培養(yǎng)微生物,它們與數(shù)據(jù)庫(kù)中α、γ、δ、ε變形桿菌和擬桿菌有很近的親緣關(guān)系。向廷生,王莉,張敏,油藏微生物及其在石油工業(yè)中的應(yīng)用,生物技術(shù),2005,15(4):87-90基金項(xiàng)目:湖北省自然基金項(xiàng)目(2004ABA144);湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2002A04010)作者簡(jiǎn)介:向廷生(1963-),男,碩士,副教授,從事石油地質(zhì)微生物方面的研究,E-mail:xiangtingsheng@sina.com。摘要:采用細(xì)菌通用引物和古細(xì)菌引物對(duì)青海油砂山油田178井本源微生物樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增,構(gòu)建基因文庫(kù),克隆和DNA序列分析。將測(cè)序結(jié)果與基因銀行進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明,油砂山樣品中有大量海桿菌屬和甲胞菌屬,樣品中還發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)甲烷古菌及一些不可培養(yǎng)的其它古菌類群。它們的功能和多樣性有待于深入研究,以便進(jìn)一步篩選用于提高該油田原油采收率的采油功能菌群。構(gòu)建16SrDNA克隆文庫(kù)是微生物分子生態(tài)學(xué)中用來調(diào)查環(huán)境中原核微生物組成的常用方法之一。1990年,Giovannoni等[1]首先用這一方法分析馬尾藻海上浮游微生物的多樣性,因?yàn)檫@一方法不需要得到環(huán)境中微生物的純培養(yǎng),突破了用傳統(tǒng)微生物分離純化的方法調(diào)查環(huán)境中微生物多樣性時(shí)很多微生物無法得到純培養(yǎng)的限制,因此這一方法目前已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于土壤、海洋、湖泊、腸道等多種生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的調(diào)查,并且揭示前所未知的環(huán)境中微生物的多樣性。為了調(diào)查青海油田本源微生物種群結(jié)構(gòu),尋找采油優(yōu)勢(shì)功能菌群,特別是能夠深入了解存在但目前尚不能培養(yǎng)的微生物類群,設(shè)計(jì)了兩套分別對(duì)應(yīng)細(xì)菌和古菌的引物,采用PCR方法直接從油田環(huán)境樣品擴(kuò)增其微生物的16SrRNA基因,然后構(gòu)建基因文庫(kù),克隆并進(jìn)行DNA序列分析,最后用獲得的基因序列在GenBank中查找與其對(duì)應(yīng)的微生物種類。這對(duì)于研究油藏條件下本源微生物生態(tài),發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)新的微生物,以及篩選采油優(yōu)勢(shì)功能菌具有重要意義。1材料與方法1.1材料(1)樣品取自青海油砂山油田油井井口油、水樣。(2)試劑和儀器酵母膏(YeastExtract)、蛋白胨(Typtone)、瓊脂糖2Agrose)、DNA聚合酶和10×Buffer(博采公司)、V2geneDNA純化試劑盒、PEMG2Teasyvector連接試劑盒(Promaga)。PCR儀、4℃(3)16SrRNA基因PCR擴(kuò)增引物[2]細(xì)菌F:52AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23細(xì)菌R:52GGTTACCTTGTTACGACTT23古菌F:52TCCGGTTGATCCTGCCRG23古菌R:52GGTTACCTTGTTACGACTT231.2實(shí)驗(yàn)步驟1.2.1樣品總基因組DNA的提取無菌條件下取100mL油砂山油、水樣品用定性濾紙過濾除去樣品中的懸浮顆粒,收集濾液,濾液通過聚碳酸酯膜(0122μm,47mm)真空過濾,濾膜用無菌緩沖液沖洗兩次。將濾膜取出剪成碎片裝入10mL的離心管中,加入360μL新鮮的溶菌酶溶液37℃溫育1h后加入115μLSDS(10%)溶液和25μl蛋白酶K(20mg/mL)溫育2h,加入400μL的5MNaCl上下顛倒混勻后在其中加入預(yù)熱到65℃的280μLCTAB溶液,65℃溫育20min。DNA提取物用標(biāo)準(zhǔn)的酚2氯仿方法進(jìn)行純化。取上清加入016倍體積的異丙醇-20℃沉淀3h,離心(14000g,20min)后去上清液,將DNA溶于30μL無菌水,加入1151.2.2樣品基因組16SrDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增及純化使用基因組16SrDNA全長(zhǎng)通用引物擴(kuò)增純菌基因組16SrDNA全長(zhǎng),PCR擴(kuò)增體系和程序見文獻(xiàn)[3,4]。將PCR產(chǎn)物濃縮后瓊脂糖凝膠(1%)電泳割膠回收,用V2geneDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。1.2.3樣品基因組16SrDNA全長(zhǎng)克隆測(cè)序用pGEM2Teasyvectorsystem(Promega公司)將16SrDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增片段與載體連接,連接產(chǎn)物通過CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,挑陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序分析(AppliedBiosystems)。應(yīng)用geneTool軟件將測(cè)序公司返回原序列進(jìn)行編輯,非嵌合體序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析,尋找親緣關(guān)系最近的細(xì)菌或克隆。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果,克隆株菌均與數(shù)據(jù)庫(kù)中同一屬的細(xì)菌具有大于90%的同源性,除了菌株CY3外,其余的菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌中的同源性均不超過98%,但是一般認(rèn)為16SrRNA序列同源性小于98%時(shí)屬于相同屬而不同種,同源性小于93%～95%時(shí)屬于不同屬。因此,克隆菌株CY3種名可以確定,而株菌CY1、CY2、CYG1、CYG2可確定屬名,但克隆菌株CYG3、CYG4、CYG5可能為屬于數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未收錄的新種。3結(jié)束語(yǔ)根據(jù)青海油田油砂山油田本源微生物樣品分子生物學(xué)初步調(diào)查結(jié)果表明,該油田地層存在豐富的細(xì)菌和古細(xì)菌,特別是海桿菌屬和單孢菌屬以及甲烷菌屬,其中很多為未培養(yǎng)微生物或新細(xì)菌種,它們的功能和多樣性有待于進(jìn)一步深入研究。根據(jù)基因銀行比對(duì)和全球微生物資源資料分析,可得到很多有價(jià)值的信息,從而為該油田采油功能微生物和菌群的研究及篩選提供依據(jù)。佘躍惠,何正國(guó),楊柳岸等，油砂山油田本源微生物分子生物學(xué)初步調(diào)查，大慶石油地質(zhì)與開發(fā)，2005,24(5)：82-84[摘要]在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下,油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移。土壤中以輕烴氣體作為其唯一碳源和能源的專性微生物在油藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常。通過檢測(cè)甲烷氧化菌及烴氧化菌的數(shù)量和活性,可以判斷地表微生物異常,從而指示地下油氣藏的分布。傳統(tǒng)的分析方法是采用經(jīng)典的微生物分離純化技術(shù),操作過程煩瑣,且工作量大。因此研究新的微生物分離方法已成為微生物勘探技術(shù)推廣應(yīng)用的必然。采集014m和115m深度油田地表土壤樣品,探討了不同的甲烷氧化菌分離方法;通過實(shí)驗(yàn)分離出了兩株形態(tài)特異的專一性甲烷氧化菌,為甲烷氧化相關(guān)基因的克隆提供了材料。并且用氣相色譜對(duì)甲烷氧化菌活性進(jìn)行了測(cè)定。在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下,油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移。土壤中以輕烴氣體作為其唯一碳源和能源的專性微生物在油藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常。通過檢測(cè)烴氧化菌的數(shù)量和活性,可以判斷地表微生物異常,從而指示地下油氣藏的分布。甲烷氧化菌屬于一類特殊的烴氧化菌群。它僅能利用C1化合物,而不能利用糖類或其他有機(jī)物,具有高度的專一性。進(jìn)行選擇性培養(yǎng)可以將甲烷氧化菌(MOB)從其他細(xì)菌中分離出來。Hanson等綜述了甲基營(yíng)養(yǎng)菌的生態(tài)及其在甲烷物質(zhì)循環(huán)中的作用。甲烷新陳代謝的過程由Leadbetter首先提出。已知微生物首先通過甲烷加氧酶活化甲烷,在有氧條件下生成甲醇,進(jìn)一步氧化可生成甲醛。甲醛可以被同化產(chǎn)生生物質(zhì)或被氧化成CO2并產(chǎn)生能量。另一類可利用C2～C5輕烴作碳源的細(xì)菌在有微量烴類存在的環(huán)境中即可生長(zhǎng),這類細(xì)菌的專一性較差,除利用烴類外,也可利用多糖和其他有機(jī)物。長(zhǎng)期在微量輕烴環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物在C2～C5為碳源的培養(yǎng)基中也可以迅速生長(zhǎng);而在非輕烴環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物在C2～C5為碳源的培養(yǎng)基中需要一段適應(yīng)期,生長(zhǎng)緩慢。利用這一差別可以檢測(cè)土壤中輕烴的豐度。C2～C5烴氧化菌的異?？芍甘镜叵掠筒氐姆植?。天然氣中98%以上是甲烷氣,甲烷氧化菌的異常可以指示地下氣藏的分布。下面研究油田地表土壤甲烷氧化菌的分離鑒定及活性測(cè)定。1試驗(yàn)方法1)樣品采集試驗(yàn)所用土樣取自松滋油田,采樣按無菌操作要求進(jìn)行,采樣深度分別為014m和115m。共采集19個(gè)樣品,帶回實(shí)驗(yàn)室后于4℃2)土樣預(yù)處理取50g土樣于無菌操作臺(tái)晾干,并粉碎成細(xì)顆粒狀(近粉末狀)。3)MOB的純化采用液體10倍稀釋分離培養(yǎng)與固體10倍稀釋滾管分離相結(jié)合的方法進(jìn)行分離,采用固體斜面純化分離培養(yǎng)物。4)MOR活性測(cè)定稱取20g土樣加入到干熱滅菌處理的血清瓶中,蓋上軟塞并向其中注入5ml甲烷,蓋上外蓋于30℃恒溫培養(yǎng)。采用氣相色譜檢測(cè)甲烷含量,檢測(cè)條件如下:氫離子火焰檢測(cè)器(FID),進(jìn)樣量012ml,總流速4018ml/min,柱流速116ml/min,柱溫352分離鑒定1)液體培養(yǎng)D培養(yǎng)物形態(tài)觀察液體培養(yǎng)D的血清瓶壁(瓶口塞有棉花)上有一圈白色帶,且液面有一薄層白色膜,此膜可能是好氧性的是甲基菌。觀察到血清瓶?jī)?nèi)液體培養(yǎng)物底部土樣上表面有一些白色衣帶狀薄層,可能是表面菌膜沉積下來而形成的。還發(fā)現(xiàn)有2個(gè)樣品的血清瓶壁上有黏液狀物質(zhì),液面有紗衣狀白色薄膜,底部土樣沉淀上方有白色衣帶狀薄層。顯微觀測(cè)液態(tài)培養(yǎng)物的細(xì)胞形態(tài):①G1土樣懸液,放大40倍形態(tài)特征為微球狀;②C1底部沉淀上表面白色衣帶狀物,放大40倍為微球狀、球狀(較大)、團(tuán)狀,放大100倍為短桿狀、中間有隔膜、微球狀、團(tuán)狀;③C1土樣懸液,放大40倍為球狀,放大100倍為短桿狀。2)液體10倍稀釋法分離培養(yǎng)物形態(tài)觀察將經(jīng)過選擇性培養(yǎng)的土樣制備為懸液進(jìn)行液體10倍稀釋法分離培養(yǎng)時(shí),生長(zhǎng)不是很明顯。當(dāng)培養(yǎng)1周時(shí)間后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)管內(nèi)有界面膜(即液體培養(yǎng)基與空氣接觸處會(huì)有一層無色膜),有的液體培養(yǎng)物內(nèi)部也會(huì)出現(xiàn)白色紗衣狀膜片。取出培養(yǎng)液進(jìn)行顯微觀察,這些細(xì)菌呈現(xiàn)出球形、短桿形及鏈桿形。3)固體10倍稀釋滾管分離培養(yǎng)物形態(tài)觀察液態(tài)培養(yǎng)D及固態(tài)培養(yǎng)A,B,C的土樣懸液經(jīng)10倍稀釋法滾管分離培養(yǎng),在1025,1026,1027三個(gè)稀釋度均有菌落出現(xiàn)。有3種形態(tài)的菌落,一種為白色圓形或點(diǎn)狀;另一種為青色,類似于霉菌;還有一種為黃色點(diǎn)狀。4)固體斜面純化培養(yǎng)的菌落形態(tài)觀察經(jīng)過固體斜面純化培養(yǎng)分離出兩株MOB,形態(tài)特征為:①青色菌落,類似于霉菌,橢圓形,個(gè)體很大,100倍油鏡可見細(xì)胞核及處于雙核狀態(tài)的細(xì)胞;②白色菌落,培養(yǎng)基內(nèi)部呈圓點(diǎn)狀,露于空氣中類似于霉菌,有纖維狀菌絲體,中間有隔膜微球菌,二連球菌,鏈球菌,低倍鏡下呈短桿狀,鏈桿狀。3活性測(cè)定在甲烷氧化菌活性測(cè)定的試驗(yàn)中,甲烷的量變化不大。產(chǎn)生這種低氧化速率的原因是由于土樣的低含水量所引起的。由于發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)都離不開水的參與,濕度的降低對(duì)細(xì)胞的最直接影響是外源無機(jī)鹽無法通過正常途徑為細(xì)胞所吸收。盡管低的濕度使得土樣對(duì)甲烷的通透性較好,甲烷能與更多的MOB相接觸,但由于缺乏足夠的溶劑水來運(yùn)輸細(xì)胞生長(zhǎng)所需的無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由此而造成對(duì)甲烷的吸收效率相當(dāng)?shù)汀?結(jié)論1)通過對(duì)土樣進(jìn)行不同的選擇性培養(yǎng)及隨后的分離純化工作,得到了兩株形態(tài)特異的甲烷氧化菌,是否屬于新的種屬仍有待于進(jìn)一步研究。2)甲烷氧化菌活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明在含水量很低的情況下(土樣幾乎呈粉末狀)甲烷氧化菌對(duì)外源性甲烷的氧化能力非常有限。3)篩分出的兩株MOB中有一株菌落顏色呈青色,類似于霉菌菌落,但顯微鏡觀察卻發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞形體很大且不能被革蘭氏染色法染色。處于芽孢態(tài)菌體。4)經(jīng)分離純化所獲得的另一株菌的單個(gè)菌落在顯微鏡下可觀察到不同形態(tài)的菌體,有圓球狀,二鏈球狀,鏈球狀及菌絲體狀。其分類學(xué)鑒定尚需深入的研究。向廷生,汪保衛(wèi),油田地表土壤甲烷氧化菌的分離鑒定及活性測(cè)定,石油天然氣學(xué)報(bào)(江漢石油學(xué)院學(xué)報(bào)),2005,27(2):324-328[作者簡(jiǎn)介]向廷生(1963),男,1989年大學(xué)畢業(yè),碩士,副教授,主要從事石油地質(zhì)微生物方面的研究。石油微生物資料(非石油學(xué)院)[摘要]針對(duì)未經(jīng)預(yù)處理的鉆井廢水中的石油污染物,通過馴化、紫外線誘變、再馴化的方法從油庫(kù)污染土壤中篩選出一株可高效降解鉆井廢水中石油烴的微生物誘變菌株YY-12,經(jīng)鑒定為酵母菌屬的CandidaBoidinii。通過單因素實(shí)驗(yàn)得到了YY-12處理廢水中石油烴的最佳溫度為33℃油氣田開發(fā)工程作為資源開發(fā)型建設(shè)項(xiàng)目,在為人類提供能源的同時(shí),會(huì)產(chǎn)生大量的鉆井廢水,給生態(tài)環(huán)境帶來影響。而石油類污染物是鉆井廢水中的主要污染源之一。鉆井廢水往往與鉆井廢泥漿一起排放,具有油含量高、成分復(fù)雜、礦化度高、腐蝕性強(qiáng)、毒性大等特點(diǎn)〔1〕。除了生產(chǎn)井之外,還有大量的探測(cè)井、檢查井的鉆探也會(huì)產(chǎn)生鉆井廢水,所以它又具有分散性和隱蔽性的特點(diǎn)〔2〕。隨著我國(guó)油氣田的不斷開發(fā)和環(huán)境保護(hù)法規(guī)的日益完善,要求必須處理的鉆井廢水會(huì)不斷增多〔3,4〕。因此,經(jīng)濟(jì)方便、無需大型設(shè)備、處理效果明顯、無二次污染的微生物處理方法成為最適宜該類廢水的處理方法,它也是目前研究的重點(diǎn)〔5,6〕。筆者針對(duì)未經(jīng)預(yù)處理的鉆井廢水,從油污土壤中分離篩選出了一株可直接用于處理鉆井廢水的高效降油菌株,并通過實(shí)驗(yàn)探索了其對(duì)石油烴的最佳降解條件。1試驗(yàn)部分1.1菌種及廢水來源菌種來源于川東鉆探公司云臺(tái)油庫(kù),鉆井廢水為川東鉆探公司鉆井廢水,石油烴質(zhì)量濃度為805.6mg/L,石油污染物種類主要為柴油。1.2培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基:牛肉膏3.0g,蛋白胨10g,NaCl15g,蒸餾水1L,pH為6.5。YPD培養(yǎng)基(酵母培養(yǎng)基):蛋白胨10g,酵母膏5.0g,葡萄糖20g,蒸餾水1L,pH為5.6。基礎(chǔ)培養(yǎng)基〔7〕:K2HPO40.5g,NH4Cl1g,Na2SO42.0g,CaCl2·6H2O0.001g,MgSO4·7H2O1.0g,FeSO4痕量,蒸餾水1L,pH為6.0。固體培養(yǎng)基為各培養(yǎng)基加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%的瓊脂。含油培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入柴油作為唯一碳源。(其他見文獻(xiàn))肖靈鈴,霍丹群,秦力,微生物法處理鉆井廢水中的石油污染物,工業(yè)水處理,2006,26(4):59-61＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄＄摘要：生物技術(shù)特別是微生物采油技術(shù)，已經(jīng)引起了石油工程技術(shù)人員的空前關(guān)注。在國(guó)內(nèi)外，微生物采油技術(shù)的先導(dǎo)性礦場(chǎng)試驗(yàn)已初見成效，較為典型的數(shù)美國(guó)和俄羅斯，我國(guó)的吉林、勝利等油田也進(jìn)行了礦場(chǎng)試驗(yàn)，增油效果鼓舞人心。同時(shí)，隨著科技的發(fā)展，一些先進(jìn)的微生物學(xué)研究工具已經(jīng)進(jìn)入微生物采油技術(shù)的研究領(lǐng)域，如分子生物學(xué)、示蹤劑及可視化技術(shù)等已經(jīng)成為微生物采油機(jī)理研究的重要工具。相關(guān)的石油烴降解理論、數(shù)學(xué)模型等也取得了系列成果。微生物采油的應(yīng)用也從開始的單井處理逐漸向整個(gè)區(qū)塊或油田發(fā)展，并見到了明顯效果。微生物采油就是利用微生物代謝產(chǎn)生的聚合物、表面活性劑、二氧化碳及有機(jī)溶劑等進(jìn)行驅(qū)油。加快國(guó)內(nèi)微生物采油技術(shù)的發(fā)展，符合我國(guó)石油工業(yè)發(fā)展的需要，有利于實(shí)現(xiàn)“穩(wěn)定東部、發(fā)展西部”的戰(zhàn)略決策。1微生物采油技術(shù)發(fā)展概況目前，微生物采油技術(shù)（MEOR）主要分美國(guó)和俄羅斯兩大學(xué)派，前者采用培養(yǎng)篩選菌種注入油藏，后者則是利用營(yíng)養(yǎng)物激活本源微生物，二者都是利用其代謝產(chǎn)物作為驅(qū)油劑提高石油采收率。在外源微生物驅(qū)油研究和應(yīng)用方面，美國(guó)的發(fā)展現(xiàn)狀基本上代表著世界微生物采油技術(shù)的水平。1990-1993年，在Phoenix油田運(yùn)行了第二輪試驗(yàn)，結(jié)果產(chǎn)量增加了19.6%，驗(yàn)證了微生物采油的可行性。本源微生物采油技術(shù)的室內(nèi)研究和礦場(chǎng)應(yīng)用，首屬俄羅斯。。1985-1994年，在韃靼、西西伯利亞、阿塞拜疆油田激活本源微生物，共增產(chǎn)原油13.49t，產(chǎn)量增加10-46%。1988-1996年，俄羅斯的11個(gè)油田區(qū)塊的44個(gè)注水井組應(yīng)用本源微生物驅(qū)油技術(shù)，共增產(chǎn)原油21×10^4t。2000年底，勝利油田東辛采油廠引進(jìn)了美國(guó)NPC公司的耐高溫菌種，在y-16井組開展了高溫油藏微生物驅(qū)油提高采收率研究和礦場(chǎng)試驗(yàn)，以期解決同類油藏微生物采油的技術(shù)問題。結(jié)果顯示，微生物采油采收率達(dá)43.41%，采收率提高5.09個(gè)百分點(diǎn)（原注水采收率38.32%），增加可采儲(chǔ)量1.81×，施工后當(dāng)年增油615.5t。2.微生物采油的研究進(jìn)展微生物采油技術(shù)經(jīng)過多年的礦場(chǎng)試驗(yàn)和應(yīng)用，取得了較為明顯的效果。隨著新的研究方法和手段的出現(xiàn)，加快了微生物采油技