GB 4789.40-2024 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌檢驗(yàn)

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)B4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌檢驗(yàn)8發(fā)布 8實(shí)施中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)國 家 市 場 監(jiān) 督 管 理 總 局 發(fā)布B4前 言本標(biāo)準(zhǔn)代替食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬阪崎桿菌檢驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)與6相比主要變化如下:修改了標(biāo)準(zhǔn)名稱;標(biāo)準(zhǔn)適用范圍增加了嬰幼兒輔助食品;增加了R鑒定方法作為選做內(nèi)容;刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產(chǎn)黃色素和苦杏仁苷項(xiàng)目;修改了培養(yǎng)基和試劑H調(diào)節(jié)方法;修改了預(yù)熱選擇性增菌溫度以及A平板的培養(yǎng)溫度和時(shí)間;修改了生化反應(yīng)的培養(yǎng)溫度及氨基酸培養(yǎng)基的制備。ⅠB4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌檢驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中克羅諾桿菌r的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方食品嬰幼兒輔助食品乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗(yàn)。設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外其他設(shè)備和材料如下。1恒溫培養(yǎng)箱6℃1℃5℃1℃。2冰箱2℃5℃0℃。3恒溫水浴箱5℃1℃。天平感量。振蕩器。: (

、 ( ) 。無菌吸管1L具1L刻度0L具1L刻度

或微量移液器及吸頭無菌容器容量000。無菌培養(yǎng)皿直徑0。計(jì)或比色管或精密試紙。微生物生化鑒定系統(tǒng)。儀。離心機(jī)轉(zhuǎn)速。凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀。 。瓊脂糖水平電泳儀或毛細(xì)管電泳儀。反應(yīng)管。。5L離心管L接種環(huán)。培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋白胨水eW見。改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯萬古霉素n見。克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基。胰蛋白胨大豆瓊脂見。生化鑒定試劑盒。氧化酶試劑見。: 。賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

見51B4鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基見。精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基見。糖類發(fā)酵培養(yǎng)基見。西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基見。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)R引物見表基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列見附錄。5L耐熱A聚合酶。5。5L2。R緩沖液見?？肆_諾桿菌質(zhì)控菌株具有菌種保藏資質(zhì)單位提供的4或等效菌株。大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株具有菌種保藏資質(zhì)單位提供的2或等效菌株。提取試劑細(xì)菌基因組提取試劑盒。商品化反應(yīng)預(yù)混液。標(biāo)準(zhǔn)高熔點(diǎn)瓊脂糖分析純。核酸染色劑。: 。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)prE電泳緩沖液見。A加樣緩沖液見。第一法 克羅諾桿菌定性檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序克羅諾桿菌檢驗(yàn)程序見圖。2B4圖1克羅諾桿菌檢驗(yàn)程序kkkkkkkkk操作步驟kkkkkkkkk前增菌和選擇性增菌取檢樣置于無菌容器中加入0L已預(yù)熱至1℃1℃的W用手緩緩地?fù)u動(dòng)至檢樣充分溶解后6℃1℃培養(yǎng)。輕輕搖動(dòng)混勻培養(yǎng)過的前增菌液移取1L轉(zhuǎn)入0Lm肉湯中5℃1℃培養(yǎng)。分離輕輕混勻m肉湯培養(yǎng)物使用L接種環(huán)各取1環(huán)增菌培養(yǎng)物分別劃線接種于2個(gè)克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板6℃1℃培養(yǎng)或按培養(yǎng)基要求條件培養(yǎng)?？梢删浒达@色培養(yǎng)基要求進(jìn)行判定每個(gè)平板挑取至少5個(gè)可疑菌落不足5個(gè)時(shí)挑取全部可疑菌落分別劃線接種于A平板6℃1℃培養(yǎng)。鑒定選做)R試驗(yàn)環(huán)境條件和過程控制參照3規(guī)定執(zhí)行。3B4模板制備可采用熱裂解法制備模板從每個(gè)A平板上挑取2個(gè)3個(gè)克羅諾桿菌可疑菌落至L滅菌去離子水中充分混勻后0℃加熱0冰浴冷卻至室溫n離心0取上清液作為A模板用于R鑒定。若上清液不能及時(shí)分析則于0℃保存?zhèn)溆?周以內(nèi)。注也可用等效商品化的細(xì)菌基因組提取試劑盒或全自動(dòng)核酸提取儀按操作要求提取模板。擴(kuò)增引物鑒定用引物信息見表。表1克羅諾桿菌鑒定用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔R引物序列目的基因引物序列片段長度p內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))上游引物'2下游引物'反應(yīng)體系反應(yīng)體系組成見表。表2克羅諾桿菌鑒定用檢測反應(yīng)體系組成試劑反應(yīng)體積L終濃度滅菌去離子水5—R緩沖液5—5L255L5P02L上游引物)0L下游引物)0LDNA模板0—5L耐熱A聚合酶55L總體積0—注也可用商品化反應(yīng)預(yù)混液按要求制備反應(yīng)體系。3反應(yīng)條件4℃預(yù)變性54℃變性1℃退火2℃延伸5個(gè)循環(huán)2℃延伸54℃下保存。對(duì)照設(shè)置鑒定時(shí)使用克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株模板作為陽性對(duì)照大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株A模板作為陰性對(duì)照提取過程設(shè)置滅菌去離子水作為A提取空白對(duì)照R反應(yīng)需另設(shè)滅菌去離子水作為反應(yīng)體系空白對(duì)照。4B4電泳用E電泳緩沖液制備含核酸染色劑的5瓊脂糖電泳凝膠核酸染色劑按照說明書要求使用在電泳槽中加入電泳緩沖液使液面沒過膠面。將適量擴(kuò)增產(chǎn)物與加樣緩沖液混合后點(diǎn)樣其中第1孔加入p。電壓的設(shè)置根據(jù)公式電泳槽正負(fù)極的距離×5計(jì)算并設(shè)置電泳時(shí)間為00。使用凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀觀察和記錄結(jié)果。也可采用毛細(xì)管電泳儀等設(shè)備進(jìn)行電泳。鑒定結(jié)果判定質(zhì)控系統(tǒng)陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶陽性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小序列信息見附錄的擴(kuò)增條帶則檢測系統(tǒng)正常。任一種對(duì)照出現(xiàn)非上述正常結(jié)果應(yīng)重做試驗(yàn)同時(shí)排除干擾因素。陽性結(jié)果在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶判定R結(jié)果為陽性。陰性結(jié)果在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下待測樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶判定R結(jié)果為陰性。確證試驗(yàn)選做3時(shí)自R結(jié)果陽性的A平板上挑取菌落進(jìn)行生化鑒定R結(jié)果陰性的A平板不再進(jìn)行生化鑒定。未選做3時(shí)直接將2的可疑菌落接種A平板后進(jìn)行生化鑒定?？梢允紫辱b定克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板上最具特征性的菌落接種的平板上的菌落。如果是陽性則不需要測試其他平板上的菌落。如果是陰性則選取其他平板上的菌落進(jìn)行鑒定直到全部為陰性或發(fā)現(xiàn)陽性菌落為止。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)平板上的菌落進(jìn)行鑒定時(shí)應(yīng)使用新鮮的傳代菌落?？肆_諾桿菌的主要生化特征見表。上述鑒定也可選擇商品化生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行。表3克羅諾桿菌的主要生化特征生化試驗(yàn)特征氧化酶-賴氨酸脫羧酶-鳥氨酸脫羧酶+)精氨酸雙水解酶+檸檬酸水解+)發(fā)酵山梨醇-)鼠李糖+蔗糖+蜜二糖+注9陽性-9陰性+09陽性-09陰性。5B4結(jié)果與報(bào)告根據(jù)菌落特征確證試驗(yàn)生化鑒定或R鑒定結(jié)果報(bào)告樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌。第二法 克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)操作步驟樣品的稀釋取檢樣各3份分別置無菌容器中分別加入00、9已預(yù)熱至1℃1℃的W用手緩緩地?fù)u動(dòng)至檢樣充分溶解制成0樣品勻液6℃±1℃培養(yǎng)。輕輕搖動(dòng)混勻培養(yǎng)過的前增菌液分別移取1L轉(zhuǎn)入0Lm肉湯,5℃1℃培養(yǎng)。分離鑒定同3和。8結(jié)果與報(bào)告綜合菌落特征確證試驗(yàn)生化鑒定或鑒定結(jié)果根據(jù)檢出克羅諾桿菌的陽性管數(shù)檢索表報(bào)告樣品中克羅諾桿菌的N值見附錄C中表。6B4附 錄A培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋白胨水)成分蛋白胨 g氯化鈉( · )

g磷酸氫二鈉

4

O

g磷酸二氫鉀 g蒸餾水 0L制法加熱攪拌至溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)1℃高壓滅菌5。滅菌后的培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯萬古霉素n-)改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯成分氯化鈉 g胰蛋白胨 g乳糖 g磷酸二氫鉀 g磷酸氫二鉀 g十二烷基硫酸鈉 g蒸餾水 0L制法加熱攪拌至溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)。分裝至無菌試管中每管01℃高壓滅菌5。滅菌后培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。萬古霉素溶液成分萬古霉素 0g蒸餾水 0L制法0g萬古霉素溶解于0L蒸餾水中過濾除菌。萬古霉素溶液可以在0℃5℃保存。7B4改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯萬古霉素n)每0LT加入萬古霉素溶液1混合液中萬古霉素的終濃度為。注m需在h之內(nèi)使用。胰蛋白胨大豆瓊脂)成分胰蛋白胨 g植物蛋白胨 g氯化鈉 g瓊脂 g蒸餾水 0L制法加熱攪拌至溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)1℃高壓5滅菌后的培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。氧化酶試劑成分NN四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽 g蒸餾水 0L制法少量新鮮配制于冰箱內(nèi)避光保存在7d之內(nèi)使用。試驗(yàn)方法用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落涂布在用氧化酶試劑濕潤的濾紙平板上。如果濾紙?jiān)趕中之內(nèi)未變?yōu)樽霞t色紫色或深藍(lán)色則為氧化酶試驗(yàn)陰性否則即為氧化酶試驗(yàn)陽性。注:實(shí)驗(yàn)中切勿使用鎳/鉻材料。賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基成分賴氨酸鹽酸鹽e) g酵母浸膏 g葡萄糖 g溴甲酚紫 g蒸餾水 0L制法將各成分加熱溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)。每管分裝5上面滴加一層液體石蠟1℃高壓5。滅菌后的培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。8B4試驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基液面下6℃1℃培養(yǎng)觀察結(jié)果賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性者培養(yǎng)基呈紫色陰性者為黃色空白對(duì)照管為紫色。鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基成分鳥氨酸鹽酸鹽e) g酵母浸膏 g葡萄糖 g溴甲酚紫 g蒸餾水 0L制法將各成分加熱溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)。每管分裝5上面滴加一層液體石蠟1℃高壓5。滅菌后的培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。試驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基液面下6℃1℃培養(yǎng)觀察結(jié)果鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性者培養(yǎng)基呈紫色陰性者為黃色空白對(duì)照管為紫色。精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基成分精氨酸鹽酸鹽e) g酵母浸膏 g葡萄糖 g溴甲酚紫 g蒸餾水 0L制法將各成分加熱溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)。每管分裝5上面滴加一層液體石蠟1℃高壓5。滅菌后的培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。試驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于精氨酸脫羧酶培養(yǎng)基液面下6℃1℃培養(yǎng)觀察結(jié)果精氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性者培養(yǎng)基呈紫色陰性者為黃色空白對(duì)照管為紫色。糖類發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分酪蛋白酶消化) g9B4氯化鈉 g酚紅 g蒸餾水 0L制法將各成分加熱溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)。每管分裝51℃高壓5。滅菌后的培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。糖類溶液山梨醇鼠李糖蔗糖蜜二糖)成分糖 g蒸餾水 0L,分別稱取,分別稱取山梨醇鼠李糖蔗糖蜜二糖等各分別溶于0L蒸餾水中過濾除菌后各制成0L的糖類溶液。完全培養(yǎng)基成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基 5L糖類溶液 5L制法無菌操作將2中制備的每種糖類溶液各自加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混勻后分別制成每一種糖的完全培養(yǎng)基再分裝到無菌試管中每管0。試驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于2中制備的各種糖類發(fā)酵培養(yǎng)基的液面下6℃1℃培養(yǎng)觀察結(jié)果。糖類發(fā)酵試驗(yàn)陽性者培養(yǎng)基呈黃色陰性者為紅色空白對(duì)照管為紅色。西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基成分檸檬酸鈉 g氯化鈉 g磷酸氫二鉀 g磷酸二氫銨 g硫酸鎂 g溴麝香草酚藍(lán) g瓊脂 g蒸餾水 0L0B4制法將各成分加熱溶解必要時(shí)調(diào)節(jié)后分裝到試管中每管01℃高壓5冷卻后制成斜面。滅菌后的培養(yǎng)基5℃時(shí)的H應(yīng)為。試驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于2中制備的培養(yǎng)基整個(gè)斜面6℃1℃培養(yǎng)觀察結(jié)果。陽性者培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色陰性者為綠色空白對(duì)照管為綠色。R緩沖液成分1LH) 0L氯化鉀) g滅菌去離子水 0L制法將氯化鉀置于少許1LH中充分溶解后用1LH定容至01℃高壓滅菌5分裝后0℃保存。E電泳緩沖液成分s ( · )

gaAO

g冰乙酸) 1L滅菌去離子水 9L制法將s和a同時(shí)溶于0L滅菌去離子水充分?jǐn)嚢杈鶆蚣尤氡宜岢浞秩芙夂?用1LH調(diào)H至并用去離子水定容至0L后室溫保存。使用時(shí)用去離子水稀釋0倍即為E電泳緩沖液。加樣緩沖液成分溴酚藍(lán) g二甲苯氰F g5L) 6L甘油 0L滅菌去離子水 0L制法5L溶于0L滅菌去離子水中加入溴酚藍(lán)和二甲苯氰F溶解與甘油混合并用滅菌去離子水定容至0分裝后4℃保存。1B4附 錄B克羅諾桿菌基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列克羅諾桿菌基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列如下:taccccaagtgctattt-'注:加粗部分為引物合成參考序列。2B4附 錄C克羅諾桿菌最大可能數(shù)檢索表每檢樣中克羅諾桿菌最可能數(shù)的檢索見表。表1克羅諾桿菌最可能數(shù)檢索表陽性管數(shù)MPN5可信限陽性管數(shù)MPN5可信限001下限上限001下限上限0003—5220152001356221874010351222574011128230974020228231674030