SN-T 2754.12-2011出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2754.12—2011出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法第12部分：溶藻弧菌2011-02-25發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I—第1部分：金黃色葡萄球菌；——第3部分：志賀氏菌；——第6部分：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌； 本部分按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。1出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法第12部分：溶藻弧菌NMKLNo.156食品中致病性弧菌的檢測和計(jì)數(shù)GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4防污染措施Betaine:甜菜堿Bst酶[BstDNApolymerase(largefragment)]:Bst/DNA聚合酶(大片段)CT(choleratoxin):霍亂毒素dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate):脫氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediatedisothermalamplification):環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增26技術(shù)概要異性識別靶序列上的7個(gè)獨(dú)立區(qū)域。利用Bst酶啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在膠原酶基因序列啟動(dòng)瓦補(bǔ)鏈除有特殊說明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級水的要求。7.1引物：根據(jù)溶藻弧菌屬特有的靶序列設(shè)計(jì)一套特異性引物，包括外引物1,外引物2,內(nèi)引物1,內(nèi)引物2和環(huán)狀引物。外引物1(F3,5’-3’):CAGCACGCGTACTTACCG外引物2(B3,5'-3’):TCAGCACCGATTGATGACG內(nèi)引物1(FIP,5'-3’):TTGCGCATATACCAGTGCTGGGTTTTCAAGTGACCCAGTGGCTTAC內(nèi)引物2(BIP,5°-3’):TGGGCAGTGGAACGAGCAATTTTTTTCCTCAGAGCAAAATCGCCTA環(huán)狀引物(LB,5’-3’):AACCAAACAGA7.3dNTP:10mmol/L。8.3水浴鍋或加熱模塊：65℃±1℃和100℃±1℃。9檢測程序食品中溶藻弧菌LAMP檢測程序見圖1。3LAMP反應(yīng)結(jié)果觀察陰性陽性報(bào)告圖1食品中溶藻弧菌LAMP檢測程序a)直接取增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中，7000g離心2min,盡量吸棄上清液；b)加入50μLDNA提取液，混勻后沸水浴10c)于7000g離心2min,上清液即為模板DNA;取上清液置-20℃可保存6個(gè)月備用。10.2.2可疑菌落模板DNA的制備對于10.1分離到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照10.2.1b)步驟制備模板DNA以待1)采用下述方法，也可使用等效的商品化的DNA提取試劑盒，并按其說明提取制備模板DNA。4表1溶藻弧菌LAMP反應(yīng)體系工作液濃度pl.反應(yīng)體系終濃度ThermoPol緩沖液外側(cè)上游引物(F3)外側(cè)下游引物(B3)內(nèi)側(cè)上游引物(FIP)內(nèi)側(cè)下游引物(BIP)環(huán)狀下游引物(LB)甜菜堿6硫酸鎂3BstDNA聚合酶8U/μL13去離子水3——10.3.2.1按表1所述配制反應(yīng)體系10.3.2.2于65℃恒溫?cái)U(kuò)增60mm,80℃2mip使酶失活，反應(yīng)即結(jié)束。陽性對照制備：將溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于3%氧化鈉堿性蛋白胨水(APW)中36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,用無菌生理鹽水稀釋至約10°CFU/mL~10°CFU/mL(約麥?zhǔn)蠞岫?.4),按10.2.1提取5(資料性附錄)溶藻弧菌膠原酶基因序列(部分)及LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖(accessionno.DQ097161)641TGCAGCACGCGTACTTACCGCAAGTGACCCAGTGGCTTACACGTTGGAATGATCAATACG701CCCAGCACTGGTATATGCGCAATGCGGTTAATGGTGTTTTCACTATTTTGTTTGGTGGGCGGGTCGTGACCATATACGCGTTB1c一761AGTGGAACGAGCAATTTGTGCAAATAATTGG]AACCAAACAGACCTTGCCGAAGCTTTAC 821GCGATTTTGCTCTGAGGGCGTCATCAATCGGTGCTGAAGATGAGTTTATGGCCGCGAATGCGCTAAAACGAGACTCCGCAGTAGTTAGCCACGACTF3(5'-3’):CAGCACGCGTACTTACCGB3(5’-3’):TCAGCACCGATTGATGACGFIP(F1c+F25’-3’):TTGCGCATATACCAGTGCTGGGTTTTCAAGTGACCCAGTGGCTTACBIP(B1c+B25'-3”):TGGGCAGTGGAACGAGCAATTTTTTTCCTCAGAGCAAAATCGCCTALB(