羅氏沼蝦雙順反子病毒-1檢測規(guī)程

1羅氏沼蝦雙順反子病毒-1檢測規(guī)程子病毒-1檢測程序的構(gòu)成、試劑和材料、器材與設(shè)備、操作步驟和結(jié)本標(biāo)準(zhǔn)適用于羅氏沼蝦雙順反子病毒-1的檢測及關(guān)聯(lián)疾病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和監(jiān)GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采SC/T7202.1斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒病診斷規(guī)程第1部分：壓片顯羅氏沼蝦雙順反子病毒-1Macrobrachiumrosenbergiiditaihuvirus，MrTV屬于小R30nm的二十面體球形顆粒，核酸類型為單股正鏈RNA，長度約10.3kb。其主要侵染羅氏沼蝦幼體甲殼下上皮組織和神經(jīng)節(jié)，造成肝臟和結(jié)締組織出現(xiàn)強(qiáng)嗜堿性細(xì)胞質(zhì)包涵體。4縮略語DEPC：焦乙酸二乙酯（DiethylpyrocarbonatDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacidATP：脫氧腺苷三磷酸（DeoxyadenosinetdCTP：脫氧胞苷三磷酸（DeoxycytidinedGTP：脫氧鳥苷三磷酸（DeoxyguanosinetdNTP：脫氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidet2dTTP：脫氧胸苷三磷酸（DeoxythymidinetMrDV-1:羅氏沼蝦雙順反子病毒-1（MacrobraMrTV：羅氏沼蝦太湖病毒（MacrobrachiumrosM-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）RdRp：RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymeraRNA：核糖核酸（RibonucleicRNasin：核糖核酸酶抑制劑（RNaseinhibiRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reversetranscriptionpolym36.4M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶：200U/μL20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。6.7TaqDNA聚合酶：5U/μL20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。6.8DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：DNAMarkerDL200020℃保存。6.12陽性對(duì)照為已知受MrTV感染且RT-PCR結(jié)果顯示強(qiáng)陽性的蝦組6.13陰性對(duì)照為已知未受MrTV感染且RT-PCR結(jié)果顯示陰性的蝦組織87.5低溫高速離心機(jī)：溫度可設(shè)置范圍0℃~40℃,最高可設(shè)定轉(zhuǎn)速≥15000轉(zhuǎn)/分鐘。4鮮活幼體、仔蝦及體長在3cm以下稚蝦個(gè)體樣品約30mg～50mg(去掉稚蝦眼)；成蝦取約30mg~8.3RT-PCR操作對(duì)每一份樣品，在一支無RNA酶的0.2mLPCR管中，加入1.5μL10μM引物MrTV572R1，2.5μL無μL5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、1μLRNasin(40U/μL)、0.5μL10mmol/LdNTPs、0.5μLM-MLV5緩沖液剛好淹沒膠面，將5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1μ9結(jié)果判定照在572bp處無任何條帶，以無RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無任何條帶第二輪PCR擴(kuò)增：陽性對(duì)照在472bp處會(huì)有特定條帶出現(xiàn)；陽性樣品在在472bp處無任何條帶，以無RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無任何條帶出3．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成份抑制PCR。陰性對(duì)照組或空白對(duì)照組在第一二次PCR擴(kuò)增后在472bp處有條帶出62.檢查逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑，重新合成性對(duì)照和樣品出現(xiàn)較多雜帶或明顯的1．未注意低溫操作，使PCR出現(xiàn)非特2．酶活性變化、dNTPs濃度變化或107在無RNA酶的玻璃量筒中配制，混勻，按1.0mL/支分裝于無RNA酶的1.5mL微量離心管中，保存于-20℃待用。A.2無RNA酶的水A.31×電泳緩沖液Tris4.A.56×載樣緩沖液8外源性的RNA酶污染是指來自于水、玻璃制品、塑料器皿、電泳槽、操作人員和微生物等?？赏ㄟ^DEPC、氯仿、干熱烘烤等方法來消除。本附錄主應(yīng)使用經(jīng)DEPC處理的水配制，然后經(jīng)無RNA酶的0.22μm微孔濾膜DEPC的水中浸泡12小時(shí)，然后經(jīng)高壓蒸汽滅菌，最后烘干。沫、落塵帶入RNA酶的污染，必要的情況下戴口罩和實(shí)驗(yàn)帽，或在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行9ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAATTAGGTGCTTCTATTTMrTV572F14582CGGCTCGTAAGGGTATAGTGTCTTATTTTCCGCGCGTGAATGAGTTGTCTAGTCTTAGTG4642GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT4702TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA4762GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG4822TTCATGGTGATTGTTGTGCTCCCTACATAATGTTTAATCCGTCTTCGCGTGCTAAGATTG4882TGGGTCTCCATTGTGCTGGATTTGCTCAGACATCTCGAGTGTTTGCTCAAATGATAACGC4942AGGAGGATATTGCTAGTGCTAT