DB1509T 0008-2024馬鈴薯脫毒苗繁育技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB05DB1509Codeofpracticefortheproductionin-vitro烏蘭察布市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由烏蘭察布市農(nóng)牧局提出并歸口。本文件起草單位：烏蘭察布市種業(yè)工作站、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院、烏蘭察布市科學(xué)事業(yè)發(fā)展中心、烏蘭察布市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心、烏蘭察布市財(cái)政預(yù)算績(jī)效評(píng)價(jià)中心、烏蘭察布市科技創(chuàng)新中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)人工影響天氣中心。本文件主要起草人：趙玉平、?？∶馈⒅腔?、崔健、郝帥、戎素平、于國林、何瑞兵、辛悅、郭巖峰、董其冰、姚國宇、朵嵐、黃修梅、王靜、李海青、劉偉、武振亞、王碧春、彭淑淵、閆秀麗。1馬鈴薯脫毒苗繁育技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了馬鈴薯莖尖脫毒與組織培養(yǎng)、脫毒苗繁育技術(shù)要求和操作規(guī)程。本文件適用于烏蘭察布地區(qū)的馬鈴薯種薯莖尖脫毒和組培苗的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29375-2012馬鈴薯脫毒試管苗繁育技術(shù)規(guī)程GB/T29378馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1葉原基ieafprimordium在莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的基部形成的突起。3.2莖尖stemtip莖頂端部分（0.1mm～0.3mm），其中包括分生組織及芽原基和正在發(fā)育的葉原基。3.3莖尖分生組織meristem莖部位具有持續(xù)或周期性分裂能力的細(xì)胞群。3.4組培苗plantlet馬鈴薯優(yōu)良品種的塊莖，利用莖尖脫毒技術(shù)、脫毒苗擴(kuò)繁技術(shù)獲得的，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)后不帶有馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯M病毒（PVM）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd），用于生產(chǎn)原原種的再生苗。4脫毒流程4.1培養(yǎng)基制備4.1.1培養(yǎng)基的配方2莖尖培養(yǎng)基配方符合GB/T29375-2012中附錄B，MS培養(yǎng)基配方符合GB/T29375-2012中附錄C。4.1.2培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基分裝于容器中，用封口膜封口。4.1.3滅菌將盛有培養(yǎng)基的容器置于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min，冷卻后在無菌貯存室放置3d～5d,無污染的培養(yǎng)基放到超凈工作臺(tái)備用。4.2材料的選擇和處理4.2.1篩選無馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的材料。4.2.2在生長(zhǎng)季節(jié)選擇具有原品種典型特征的單株材料，收獲并通過休眠后，將薯塊在溫室或培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行催芽處理。4.2.3對(duì)待脫毒材料進(jìn)行高溫鈍化處理。溫度37℃,處理時(shí)間15d?；蛘邔冸x好的莖尖放入生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)，放入生長(zhǎng)箱在25℃下處理20h～21h，之后在40℃下處理4h～5h，其間1500Lx～2000Lx光照12h，黑暗12h，鈍化時(shí)間在4w～6w。4.3莖尖脫毒4.3.1莖尖消毒待芽萌發(fā)至2cm～3cm時(shí)，選取粗壯的芽，用解剖刀切下，芽段用無菌水沖洗30min，再用75%的酒精浸泡30s，放入無菌杯內(nèi)用10%的次氯酸鈉浸泡15min，用無菌水沖洗2～3次后放入滅菌后的超凈工作臺(tái)中。4.3.2莖尖剝離及接種將經(jīng)消毒后的莖尖放在無菌濾紙上吸干水分，在40倍解剖鏡下用滅菌的解剖刀、解剖針剝?nèi)б粋€(gè)葉原基的莖尖（0.1mm～0.3mm），將生長(zhǎng)點(diǎn)迅速接種于盛有莖尖培養(yǎng)基的容器中，進(jìn)行離體培養(yǎng)。4.4莖尖組織培養(yǎng)4.4.1溫度15℃~25℃,光照強(qiáng)度2000Lx～3000Lx，光照時(shí)間16h/d，培養(yǎng)120d～140d。4.4.2當(dāng)看到明顯生長(zhǎng)的小莖，葉原基形成可見的小葉，轉(zhuǎn)入無生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中。4.4.3小苗繼續(xù)生長(zhǎng)并形成根系并發(fā)育成3～4個(gè)葉片的試管苗。4.5病毒檢測(cè)以單株為系進(jìn)行擴(kuò)繁，苗數(shù)達(dá)150～200株時(shí)，隨機(jī)抽取3～4個(gè)樣本，每個(gè)樣本10～15株，進(jìn)行病毒檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)確認(rèn)不帶有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和往復(fù)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)確認(rèn)不帶有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）。4.6性狀檢驗(yàn)經(jīng)檢驗(yàn)不帶病毒的組培苗進(jìn)行擴(kuò)繁試種觀察。將每個(gè)組培苗取出一部分，將根部培養(yǎng)基清洗干凈后移栽到防蟲網(wǎng)棚，結(jié)出的小薯種植到田間試種觀察，檢驗(yàn)其是否發(fā)生變異，符合原品種特性的典型性狀的脫毒苗即為核心苗。35基礎(chǔ)苗培養(yǎng)器皿表面用75%的酒精擦試消毒，用鑷子取出核心苗，按單莖切段，每個(gè)段至少帶一片小葉，腋芽朝上插入MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。溫度15℃~25℃,相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度2000Lx～3000Lx，光照時(shí)間16h/d。6組培苗的快速擴(kuò)繁6.1擴(kuò)繁前采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)基礎(chǔ)苗是否帶病毒（PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM），往復(fù)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)基礎(chǔ)苗是否帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）。6.2檢測(cè)合格的基礎(chǔ)苗在超凈工作臺(tái)上切斷擴(kuò)繁。將培養(yǎng)容器置于超凈工作臺(tái)上，瓶口用75%乙醇擦拭消毒，用滅菌的長(zhǎng)鑷子取出基礎(chǔ)苗，按單莖節(jié)切段，每個(gè)切段至少帶一個(gè)葉片，腋芽朝上插入MS培養(yǎng)基，用酒精燈烘烤瓶口，用封口膜封好，注明編號(hào)、品種名稱、接種時(shí)間。6.3培養(yǎng)條件為：白天23℃~25℃,夜間16℃~20℃,光照強(qiáng)度2000Lx～3000Lx，光照時(shí)間14h/d～16h/d，培