急性吸入毒性試驗(yàn) 急性毒性分類法

附件194急性吸入毒性試驗(yàn)急性毒性分類法AcuteInhalationToxicity-AcuteToxicClassMethod1范圍本試驗(yàn)方法規(guī)定了急性吸入毒性試驗(yàn)急性毒性分類法的試驗(yàn)原則、試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)和報(bào)告。本試驗(yàn)方法適用于化妝品原料急性吸入毒性的急性毒性分類。本試驗(yàn)方法適用于單一成分的化妝品原料，非單一成分的原料若使用本方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，需要提供更多的科學(xué)依據(jù)說明其可行性。本試驗(yàn)方法不適用于測(cè)試某些特殊的材料，如難溶的等軸狀（isometric）或纖維狀（fibrous）材料、或人造納米材料（manufacturednanomaterials）。2試驗(yàn)?zāi)康谋驹囼?yàn)方法的目的是通過測(cè)試獲得受試物的健康危害信息等資料，從而可參考聯(lián)合國(guó)全球化學(xué)品分類和標(biāo)簽管理協(xié)調(diào)制度（theUnitedNations（UN）GloballyHarmonizedSystem（GHS）ofClassificationandLabellingofChemicals）的化學(xué)品急性毒性分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其急性毒性進(jìn)行分類。3定義3.1急性吸入毒性分類法按照一定的連續(xù)試驗(yàn)步驟和相應(yīng)的濃度進(jìn)行測(cè)試，從而獲得受試物的毒性分類和半數(shù)致死濃度（LC50,LethalConcentration50%）估測(cè)范圍的試驗(yàn)方法。3.2計(jì)算濃度nominalconcentration使用受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)空氣的總體積所得到的濃度。3.3實(shí)際濃度actualconcentration在吸入式染毒柜中動(dòng)物呼吸道中的受試物濃度，可通過特異性（如直接采樣、吸附或化學(xué)反應(yīng)等方法進(jìn)行采樣、分析）或非特異性（如濾膜增重法）等方法進(jìn)行測(cè)試分析。4試驗(yàn)原則本試驗(yàn)采用分步試驗(yàn)的方法，觀察試驗(yàn)動(dòng)物暴露4h的反應(yīng)，從而得到滿足對(duì)受試物急性吸入毒性等級(jí)進(jìn)行分類的信息。為了特殊的監(jiān)管目的也可采用其他暴露時(shí)限（不是4h）的試驗(yàn)。每步試驗(yàn)使用每種性別3只動(dòng)物，在確定的濃度下進(jìn)行吸入暴露試驗(yàn)。根據(jù)動(dòng)物死亡和/或?yàn)l死狀態(tài)，有時(shí)只進(jìn)行2步試驗(yàn)操作就可以對(duì)受試物的急性吸入毒性類別做出判斷。如果有證據(jù)表明某種性別的動(dòng)物比另外一種動(dòng)物的敏感性要高時(shí)，可以只使用敏感性別動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。前面一步操作的試驗(yàn)結(jié)果決定著下一步試驗(yàn)操作：a）無需進(jìn)行下一步試驗(yàn)；b）每性別3只動(dòng)物；或c）只使用6只敏感性別的動(dòng)物。方法是每個(gè)試驗(yàn)濃度組使用6只敏感性別的動(dòng)物，性別不限，以估測(cè)的毒性類別界限范圍數(shù)值中較低的濃度來進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)瀕臨死亡的、處于難以忍受疼痛的或嚴(yán)重持久痛苦的動(dòng)物，應(yīng)人道地處死。人道處死的試驗(yàn)動(dòng)物，在結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)應(yīng)與試驗(yàn)中死亡的動(dòng)物一并對(duì)待。5試驗(yàn)方法5.1方法描述5.1.1動(dòng)物種屬的選擇應(yīng)使用健康年輕、實(shí)驗(yàn)室中常用的種屬動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。首選大鼠，如使用其他動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行論證，說明理由和依據(jù)。5.1.2動(dòng)物的準(zhǔn)備雌性動(dòng)物應(yīng)是未經(jīng)產(chǎn)的、未妊娠。要保證每步試驗(yàn)暴露時(shí)的鼠齡在8W~12W；試驗(yàn)開始時(shí)動(dòng)物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的±20%。采用隨機(jī)選擇原則，并對(duì)每只動(dòng)物做出標(biāo)記。在進(jìn)行試驗(yàn)之前至少要在籠內(nèi)飼養(yǎng)5d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件。試驗(yàn)前還需在試驗(yàn)設(shè)備中進(jìn)行短期的適應(yīng)訓(xùn)練，以減少因?yàn)檫M(jìn)入新的設(shè)備環(huán)境造成的應(yīng)激反應(yīng)。5.1.3飼養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暴露前后按性別、濃度分籠飼養(yǎng)，但是每籠動(dòng)物的數(shù)量不能妨礙對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，并應(yīng)減少由于同種相殘和相互撕咬而造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物信息的丟失。以口鼻式裝置暴露時(shí)，需將動(dòng)物放入固定管內(nèi)使其適應(yīng)固定管的環(huán)境。固定管不能過度的增加動(dòng)物體力、熱量和活動(dòng)的負(fù)荷。動(dòng)物的限制固定可能影響動(dòng)物的體溫（過熱）和/或每分鐘動(dòng)物呼吸量。如果有資料表明這些改變沒有達(dá)到可感覺到的程度，就不一定需要預(yù)先在固定管內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)操作。全身暴露氣溶膠的動(dòng)物在暴露期間需各自相隔互不接觸，防止柜體內(nèi)動(dòng)物的相互趴臥造成被毛對(duì)氣溶膠的過濾作用。除暴露期間外（暴露期間禁食），給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)檢驗(yàn)合格的飼料，自由飲水。采用人工照明，每12h明暗交替。5.1.4吸入染毒裝置要根據(jù)受試物的性質(zhì)和試驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇吸入染毒方式。首選的染毒方式是口鼻式（nose-only）暴露（其中包括僅頭部暴露、鼻部暴露或口鼻部暴露三種染毒模式）。當(dāng)受試物是液體、固態(tài)氣溶膠和能產(chǎn)生氣溶膠的蒸氣時(shí)，首選口鼻式暴露方式。對(duì)于特殊的研究目的，也可采用全身暴露（whole-body）的染毒方式以更好地滿足研究需求，但應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。為了保證全身染毒時(shí)柜體內(nèi)空氣中受試物的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的總體積不應(yīng)超過染毒柜總?cè)莘e的5%。5.2暴露條件5.2.1染毒濃度5.2.1.1推薦暴露吸入時(shí)間為4h，但需除去達(dá)到濃度穩(wěn)定平衡所需時(shí)間。根據(jù)特殊試驗(yàn)需要也可采用其他的暴露時(shí)限，但是需在試驗(yàn)報(bào)告中給予說明。全身暴露時(shí)動(dòng)物應(yīng)各自隔離互不接觸，防止染毒柜內(nèi)其他動(dòng)物的理毛行為造成經(jīng)口攝入受試物。吸入暴露期間需要禁食。全身暴露時(shí)可提供飲水。5.2.1.2動(dòng)物吸入暴露的受試物是氣體、蒸氣、氣溶膠或是它們的混合物。試驗(yàn)時(shí)將受試物制備成何種物態(tài)，取決于受試物的理化性質(zhì)、設(shè)定的濃度，和/或在實(shí)際加工應(yīng)用中最有可能使用的物理狀態(tài)等。具有吸濕性的和會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的受試物在試驗(yàn)中需保證吸入的空氣是干燥的。需注意避免使用發(fā)生爆炸的濃度進(jìn)行試驗(yàn)。5.2.2顆粒粒徑的分布對(duì)所有的氣溶膠和可能形成氣溶膠的蒸氣都需測(cè)定顆粒粒徑的大小。為了使整個(gè)呼吸道都能暴露受試物，推薦的氣溶膠顆粒的質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑（MassMedianAerodynamicDiameter，MMAD）為1μm~4μm，其幾何標(biāo)準(zhǔn)差為1.5~3.0。需盡可能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，如技術(shù)上無法滿足要求時(shí)需由專家做出評(píng)判。例如，金屬煙塵比本標(biāo)準(zhǔn)的粒徑要小，但是帶電的粒子、纖維和吸濕性受試物（在呼吸道潮濕環(huán)境下其粒徑增加）可超過這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。5.2.3溶媒選擇與受試物的配制為了制備具有合適濃度和粒徑大小的受試物，需要使用載體溶媒，作為一條規(guī)定，水是首選的載體溶媒。顆粒物需要機(jī)械加工達(dá)到要求的粒徑大小，但要注意加工中是否引起受試物的分解和變性。如機(jī)械加工改變了受試物的組成成分（如由于過度研磨、摩擦產(chǎn)生高溫），受試物的組成要經(jīng)過檢測(cè)分析進(jìn)行確認(rèn)。需注意不要污染受試物。對(duì)不能形成可吸入性的、不易成為粉末的顆粒材料不需要進(jìn)行試驗(yàn)。磨損試驗(yàn)是用來證明加工這些材料時(shí)會(huì)不會(huì)產(chǎn)生呼吸性顆粒物。如果經(jīng)磨損試驗(yàn)證實(shí)可產(chǎn)生呼吸性顆粒物，則該材料應(yīng)當(dāng)進(jìn)行吸入毒性試驗(yàn)。5.2.4對(duì)照組不需要設(shè)立平行陰性（空氣）對(duì)照。即使制備試驗(yàn)氣體的載體溶媒不是水，也只有在沒有載體溶媒歷史數(shù)據(jù)的情況下才設(shè)立溶媒對(duì)照組。如果所用溶媒制備的受試物沒有引起毒性，至少說明在該受試物濃度的條件下，溶媒是沒有毒性的，所以不需要設(shè)立溶媒對(duì)照組。5.3暴露條件的監(jiān)測(cè)5.3.1染毒裝置內(nèi)氣流通過染毒柜（裝置）的氣流速率需嚴(yán)格控制，可連續(xù)在線監(jiān)測(cè)記錄或每次暴露期間至少每小時(shí)監(jiān)測(cè)記錄一次。試驗(yàn)所用空氣中受試物濃度（或其穩(wěn)定性）的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)是對(duì)染毒系統(tǒng)中各個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)作用的綜合結(jié)果，因此這些數(shù)據(jù)可提供控制制備動(dòng)態(tài)空氣設(shè)備相關(guān)參數(shù)的間接方法。在口鼻式染毒時(shí)通過染毒系統(tǒng)的試驗(yàn)氣體的氣流動(dòng)力不足時(shí)，需注意動(dòng)物的在染毒裝置內(nèi)發(fā)生重復(fù)吸入。已有確定在所選定的操作條件下不會(huì)發(fā)生重復(fù)吸入的方法。氧氣的濃度至少為19%；二氧化碳的濃度不超過1%。如果證實(shí)確實(shí)不能達(dá)到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，需要測(cè)定并記錄試驗(yàn)空氣中氧氣和二氧化碳的濃度。5.3.2染毒裝置柜內(nèi)溫度和相對(duì)濕度染毒柜內(nèi)溫度維持在22℃±3℃?？诒鞘奖┞逗腿肀┞抖夹璞O(jiān)測(cè)記錄動(dòng)物呼吸帶的相對(duì)濕度，在吸入染毒的4h之內(nèi)至少3次；吸入染毒暴露期限較短的試驗(yàn)可以每小時(shí)監(jiān)測(cè)記錄1次。理想的相對(duì)濕度需維持在30%~70%；但是有時(shí)很難達(dá)到（如受試物以水配制），或者受試物與測(cè)定方法發(fā)生干擾而難以測(cè)定。5.3.3受試物5.3.3.1計(jì)算濃度無論何時(shí)都應(yīng)盡量記錄并計(jì)算染毒柜空氣中受試物的計(jì)算濃度。計(jì)算濃度是指制備產(chǎn)生的受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)的空氣總體積得到的參數(shù)。雖然計(jì)算濃度不是用來描述動(dòng)物暴露特征，但是可通過計(jì)算濃度與實(shí)際濃度進(jìn)行比較可以得到試驗(yàn)系統(tǒng)制備效率的指征，從而可發(fā)現(xiàn)制備染毒空氣過程中存在的問題。5.3.3.2實(shí)際濃度5.3.3.2.1實(shí)際濃度是吸入染毒柜內(nèi)動(dòng)物呼吸道中的受試物的濃度，可以通過特異性的方法（如采用吸附或化學(xué)反應(yīng)的原理直接采樣，然后進(jìn)行分析）；或是通過非特異性的方法（如濾膜增重法）來獲得。單一成分的粉末、低揮發(fā)性液體的氣溶膠才能使用增重法，同時(shí)還需要專門預(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。對(duì)多成分的粉末氣溶膠也可以用增重分析法測(cè)量，但是這需要證實(shí)所制備的空氣與最初受試物的組成成分相似。如果沒有此類數(shù)據(jù)資料，則需在試驗(yàn)期間按照規(guī)定的時(shí)間間隔對(duì)制備產(chǎn)生的空氣進(jìn)行再分析（理想的是染毒柜中的空氣）。對(duì)可揮發(fā)的或易升華的氣溶膠，需證實(shí)所用方法能收集到所有物相的受試物。需在試驗(yàn)報(bào)告中報(bào)告靶濃度（目標(biāo)濃度）、計(jì)算濃度和實(shí)際濃度，但只有實(shí)際濃度可用來計(jì)算致死濃度值。5.3.3.2.2應(yīng)使用同一批試驗(yàn)受試物。技術(shù)可行時(shí)盡可能將試驗(yàn)樣品保存在能維持純度、均勻性和穩(wěn)定性的條件下。開始試驗(yàn)前對(duì)受試物的特征有充分的了解和描述，如純度、鑒別特征和鑒定出來的污染物和雜質(zhì)。這可用以下參數(shù)來證實(shí)，如保留時(shí)間、相對(duì)峰面積和通過質(zhì)譜、氣相色譜或其他的檢測(cè)方法得到的分子量，包括且不限于以上內(nèi)容。雖然受試物樣品的特征鑒別不是實(shí)驗(yàn)室的責(zé)任，實(shí)驗(yàn)室還是需要對(duì)委托方提供的受試物進(jìn)行必要的簡(jiǎn)單有限的描述（如顏色、物理狀態(tài)等）。5.3.3.2.3需盡可能的保持染毒空氣成分穩(wěn)定，可采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟB續(xù)或間隔采樣監(jiān)測(cè)。間隔采樣時(shí)，吸入染毒4h的試驗(yàn)至少采樣2次。如果由于系統(tǒng)內(nèi)染毒空氣流量過低所限，或染毒濃度太低需采集較多的空氣樣本時(shí)而不能完全滿足連續(xù)或間隔采樣量的要求，可在整個(gè)暴露期內(nèi)只采集一個(gè)樣本。如果樣本與樣本之間出現(xiàn)明顯波動(dòng)，進(jìn)行下一個(gè)濃度試驗(yàn)時(shí)需在暴露期間采集4個(gè)樣本進(jìn)行分析。染毒空氣各個(gè)樣本之間的濃度波動(dòng)范圍應(yīng)符合規(guī)定，氣體和揮發(fā)性受試物濃度范圍不得超過平均濃度±10%，液體或固體氣溶膠濃度范圍不得超過平均值±20%。并需要計(jì)算柜內(nèi)空氣受試物達(dá)到平衡時(shí)的時(shí)間（T95）。一個(gè)暴露周期內(nèi)需要考慮到制備受試物空氣的時(shí)間和達(dá)到T95的時(shí)間。對(duì)組成非常復(fù)雜混合物的蒸氣/氣體、氣溶膠（如推動(dòng)終端裝置設(shè)備產(chǎn)生的燃燒空氣和試驗(yàn)物形成的）在染毒柜內(nèi)空氣中每一相成分物相各不相同，至少要選擇一個(gè)標(biāo)志性物質(zhì)來進(jìn)行分析，通常是受試制備物中處在某一物相（蒸氣/氣體或氣溶膠）的主要的活性物質(zhì)。如果試驗(yàn)物質(zhì)是制劑（商品形式的產(chǎn)品）分析報(bào)告的濃度應(yīng)是制劑的總濃度，不是活性成分的或某成分的濃度。5.3.3.3顆粒物粒徑的分布?xì)馊苣z的粒徑大小需在染毒的4h期間至少測(cè)定2次，方法是使用級(jí)聯(lián)撞擊采樣器或其他替代的設(shè)備如空氣動(dòng)力學(xué)粒徑儀等。如果級(jí)聯(lián)撞擊時(shí)采樣器與替代的測(cè)定方法所得到的結(jié)果相同，在整個(gè)試驗(yàn)期間的就可以使用替代的方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如采用濾膜增重或塵埃測(cè)定器/氣體發(fā)泡收集管等第二種設(shè)備檢測(cè)，則需要與基礎(chǔ)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證基礎(chǔ)檢測(cè)設(shè)備的收集效率。粒徑大小分析得到的質(zhì)量濃度應(yīng)與采用濾膜分析法得到的質(zhì)量濃度在一個(gè)合理的限度之內(nèi)。如果在試驗(yàn)開始階段就證明兩種試驗(yàn)方法的質(zhì)量濃度相同，就可以免去驗(yàn)證性試驗(yàn)。從動(dòng)物福利方面考慮，需采取措施減少無確定結(jié)果的數(shù)據(jù)資料，因?yàn)檫@會(huì)要求重復(fù)進(jìn)行暴露試驗(yàn)。如果空氣中的蒸氣受試物能發(fā)生凝結(jié)而形成氣溶膠，或者染毒蒸氣空氣中測(cè)定到顆粒物也就是暴露空氣存在潛在的混合相，則需對(duì)這種受試物進(jìn)行粒徑的測(cè)定。5.4操作步驟5.4.1正式試驗(yàn)（maintest）5.4.1.1每一步使用雌雄各3只動(dòng)物，或6只敏感性別的動(dòng)物。如果采用口鼻式暴露方式時(shí)使用的嚙齒類動(dòng)物不是大鼠，則需要調(diào)整最長(zhǎng)的暴露時(shí)間以減少動(dòng)物種屬之間的負(fù)荷的差異?？蓮?個(gè)固定的起始濃度水平染毒，這個(gè)濃度應(yīng)能引起染毒動(dòng)物中的某些動(dòng)物出現(xiàn)毒性作用。氣體、蒸氣和氣溶膠的試驗(yàn)步驟圖（見7試驗(yàn)步驟流程圖）的濃度水平是GHS第1類~4類的分類標(biāo)準(zhǔn)的界限值：氣體為（100ppm/4h、500ppm/4h、2500ppm/4h、20000ppm/4h）（見圖1）；蒸氣為（0.5mg/L/4h、2mg/L/4h、10mg/L/4h、20mg/L/4h）（見圖2）；氣溶膠為（0.05mg/L/4h、0.5mg/L/4h、1mg/L/4h、5mg/L/4h）（見圖3）。高于各相應(yīng)物態(tài)類別的上限濃度就歸為第5類。按照各自的試驗(yàn)圖表來確定起始濃度。根據(jù)人道處死和動(dòng)物試驗(yàn)死亡的數(shù)量，按照?qǐng)D中的指示的箭頭來決定下一步的試驗(yàn)，直到能對(duì)受試物作出毒性分類時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。5.4.1.2進(jìn)行下一個(gè)暴露濃度組試驗(yàn)的時(shí)間間隔長(zhǎng)短要根據(jù)毒性體征的發(fā)作時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度來決定。決定進(jìn)行暴露下一個(gè)濃度水平需要直到前一個(gè)濃度水平的動(dòng)物存活狀態(tài)完全確定下來后再進(jìn)行。建議的每個(gè)濃度水平之間的時(shí)間間隔為3d至4d，這可以觀察到可能存在的遲發(fā)毒性。如出現(xiàn)的反應(yīng)不能確定，可適當(dāng)調(diào)整時(shí)間間隔的長(zhǎng)短。5.4.2限度試驗(yàn)（limittest）5.4.2.1如已知或預(yù)期受試物幾乎無毒時(shí)可進(jìn)行限度試驗(yàn)，如在超過規(guī)定的極限濃度值以上時(shí)才引起毒性反應(yīng)的受試物。受試物的毒性的信息可從已經(jīng)檢測(cè)的類似化合物、混合物或產(chǎn)物結(jié)果得到，此時(shí)要考慮到已知的具有毒理學(xué)意義的受試物的特性、混合物構(gòu)成的百分比等。在沒有或毒性信息很少的情況下，或者是估計(jì)受試物是具有毒性，需進(jìn)行正式試驗(yàn)。5.4.2.2正常的操作程序下，使用每種性別動(dòng)物3只，或使用6只敏感性別的動(dòng)物，暴露水平分別是：氣體20000ppm；蒸氣20mg/L；粉塵/霧5mg/L（如果技術(shù)可達(dá)到）。受試物制備成氣溶膠時(shí)，粒徑的大小需達(dá)到可呼吸性粒子的大?。ㄈ鏜MAD為1μm~4μm）。絕大部分的受試物都能在2mg/L的濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)。如進(jìn)行高于2mg/L濃度水平的氣溶膠試驗(yàn)，受試物應(yīng)能夠制備成可呼吸性粒子大小。從動(dòng)物福利方面考慮，GHS不主張超過限度濃度的試驗(yàn)。5.4.2.3只在有可能直接涉及到人類健康需要的情況下才進(jìn)行GHS中第5類物質(zhì)濃度水平的試驗(yàn)，并需在試驗(yàn)報(bào)告中論述理由。對(duì)潛在爆炸性受試物試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要認(rèn)真研究避免引起發(fā)生爆炸的條件出現(xiàn)。為了避免不必要的使用動(dòng)物，開始限度試驗(yàn)前，需在染毒系統(tǒng)不放置動(dòng)物的條件下進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以確認(rèn)染毒條件是否能達(dá)到限度試驗(yàn)的水平。5.4.3觀察5.4.3.1暴露期間要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)常進(jìn)行臨床觀察。暴露染毒結(jié)束后的當(dāng)日至少要觀察2次，還可根據(jù)動(dòng)物對(duì)染毒的反應(yīng)增加觀察次數(shù)；此后的14d內(nèi)至少每日觀察1次。觀察期期限的長(zhǎng)短不是固定不變的，需要根據(jù)臨床癥狀出現(xiàn)的性質(zhì)、時(shí)間以及體征消失的長(zhǎng)短來決定。毒性體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間是十分重要的，應(yīng)特別注意是否存在毒性體征延遲出現(xiàn)的傾向，對(duì)每只動(dòng)物的所有的觀察都要分別作系統(tǒng)的記錄。5.4.3.2對(duì)處于瀕死的動(dòng)物和表現(xiàn)出嚴(yán)重的疼痛和/或持續(xù)的嚴(yán)重痛苦的動(dòng)物從動(dòng)物福利考慮要人道的處死。對(duì)最初出現(xiàn)的微弱的毒性體征和由于暴露操作引起的短暫的呼吸道的異常改變等臨床體征要認(rèn)真分析區(qū)別，不要錯(cuò)誤認(rèn)為這些都是染毒處理引起的毒性作用。要按照列在人道觀察終點(diǎn)的指南文件中“人道終點(diǎn)”的原則和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。對(duì)人道處死的或發(fā)現(xiàn)已經(jīng)死亡的動(dòng)物處死和死亡時(shí)間要盡可能的準(zhǔn)確的記錄。籠外觀察包括動(dòng)物皮膚和被毛、眼和粘膜、呼吸、循環(huán)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變，以及身體活動(dòng)和行為方式等變化。盡可能的注意局部作用與系統(tǒng)作用之間的任何差別。關(guān)注點(diǎn)主要為顫動(dòng)、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡、睡眠和昏迷。測(cè)定直腸溫度或許可為是否存在對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理或在固定管內(nèi)過度的限制造成反射性呼吸過緩、體溫過低或過高等提供證據(jù)。5.4.4體重進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境期間每只動(dòng)物至少要稱重一次；染毒當(dāng)日，在開始試驗(yàn)前（第0d）、染毒后的1d、3d、7d（此后每周記錄一次）、死亡時(shí)和染毒后超過1d以后人道處死的動(dòng)物都要稱量每只動(dòng)物的體重。體重變化是判定毒性作用的指標(biāo)，并且對(duì)于體重持續(xù)低于染毒前體重的20%要給予密切觀察。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活動(dòng)物稱量體重后并人道地處死。5.4.5病理學(xué)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括試驗(yàn)期間死亡的、人道處死的動(dòng)物和動(dòng)物福利考慮從試驗(yàn)隊(duì)列中退出的，都需進(jìn)行大體解剖檢查。如果動(dòng)物死亡后不能立即進(jìn)行解剖檢查，應(yīng)將死亡動(dòng)物放入冰箱的冷藏箱內(nèi)低溫存放，以減少動(dòng)物尸體的自溶分解。大體尸檢應(yīng)在死亡后1d~2d進(jìn)行。每只動(dòng)物大體解剖所見的病理學(xué)改變都記錄，特別注意呼吸道出現(xiàn)的任何變化。其他輔助的檢查，包括可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果做出解釋的檢查指標(biāo)，如測(cè)定存活大鼠的肺臟重量或者對(duì)呼吸道進(jìn)行顯微檢查以提供受試物刺激性的證據(jù)等。檢查的器官涉及到染毒后存活24h以上的動(dòng)物出現(xiàn)大體解剖學(xué)改變的器官、或者已知或預(yù)期可能受到影響的器官。全呼吸道的顯微組織學(xué)檢查或許可為鑒定受試物是否與水發(fā)生反應(yīng)提供非常有價(jià)值的信息，如酸類和吸濕性的受試物。6數(shù)據(jù)和試驗(yàn)報(bào)告6.1數(shù)據(jù)需提供每只動(dòng)物的體重、大體解剖檢查所見的全部資料。臨床觀察的數(shù)據(jù)需要總結(jié)成表格的形式，包括能表現(xiàn)出每個(gè)試驗(yàn)組使用的動(dòng)物數(shù)、出現(xiàn)特異性毒性體征的動(dòng)物數(shù)、試驗(yàn)期間死亡或人道處死的動(dòng)物數(shù)、每只動(dòng)物的死亡時(shí)間、詳細(xì)描述毒性作用的發(fā)生、發(fā)展的時(shí)間進(jìn)程和體征的可逆性；大體解剖所見。6.2試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告需包括以下信息：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件：—飼養(yǎng)籠具的描述：每籠動(dòng)物的數(shù)量（或動(dòng)物變化的數(shù)量）、墊料、環(huán)境溫度、相對(duì)濕度、光照周期、飼料合格認(rèn)證資料；—使用的動(dòng)物種屬和品系，不使用大鼠進(jìn)行試驗(yàn)的論證依據(jù)；—?jiǎng)游锏臄?shù)量、周齡和性別；—隨機(jī)選擇分組的方法；—?jiǎng)游锸澄铩嬎馁|(zhì)量（包括飼料的類型/來源和供水的來源）；—試驗(yàn)前的所有的包括飼料、檢疫、疾病的處理等描述。受試物：—物理性狀、純度、相關(guān)的理化性質(zhì)（包括同分異構(gòu)體）；—受試物特征性數(shù)據(jù)和化學(xué)文摘（CAS）注冊(cè)號(hào)（如果已知）。溶媒:—如果不是用水作為載體溶媒，所用的溶媒是什么，對(duì)采用這種溶媒的理由作出論述；—可證明所使用的溶媒不會(huì)干擾研究結(jié)果的既往歷史數(shù)據(jù)或平行對(duì)照數(shù)據(jù)。吸入染毒裝置：—吸入染毒裝置的描述包括大小尺度和體積；—除了描述制備染毒空氣操作外，還需動(dòng)物暴露所用設(shè)備及其來源進(jìn)行描述；—測(cè)定氣溫、濕度、粒徑大小和實(shí)際濃度的儀器設(shè)備；—空氣的來源、空氣供給/解壓處理、調(diào)節(jié)供給條件所使用的系統(tǒng)；—確保試驗(yàn)空氣均勻所使用的調(diào)節(jié)設(shè)備和方法；—壓差（正壓或負(fù)壓）；—每個(gè)吸入裝置動(dòng)物暴露孔的數(shù)量（口鼻式染毒裝置）；每個(gè)染毒裝置容納動(dòng)物的格位數(shù)量（全身染毒裝置）；—試驗(yàn)時(shí)空氣中受試物的均勻性、穩(wěn)定性；—溫度和濕度感受器、采樣孔所在的部位；—空氣流速，包括口鼻式固定孔處的空氣流速、全身染毒柜內(nèi)放置動(dòng)物處的空氣流速；—如果測(cè)定了空氣中氧氣和二氧化碳需要提供所用設(shè)備的信息；—達(dá)到吸入染毒柜空氣濃度穩(wěn)定平衡的時(shí)間（T95）；—每小時(shí)空氣體積更換次數(shù)；—計(jì)量?jī)x器設(shè)備。暴露數(shù)據(jù)：—正式試驗(yàn)中選擇設(shè)定靶濃度的理由；—計(jì)算濃度（制備的試驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)入到吸入染毒設(shè)備的總量除以通過染毒柜空氣的總體積）；—從動(dòng)物呼吸道中采樣測(cè)得的受試物的實(shí)際濃度；對(duì)制備受試物中形成不同物態(tài)的混合物（氣體、蒸氣和氣溶膠），需分別對(duì)每一物態(tài)進(jìn)行測(cè)定；—報(bào)告中所有的空氣濃度都要用質(zhì)量單位（如mg/L，mg/m3等）來表示，當(dāng)然也可以用體積單位來報(bào)告；—顆粒物粒徑大小的分布用MMAD和幾何標(biāo)準(zhǔn)差來表示，同時(shí)列出得到這個(gè)參數(shù)的計(jì)算方法。應(yīng)在報(bào)告中記錄每個(gè)檢測(cè)到的粒徑大小的數(shù)據(jù)。試驗(yàn)條件:—受試物制備的詳細(xì)操作，包括固態(tài)物質(zhì)被制備成為直徑更小的顆粒物或制備成溶液的詳細(xì)操作過程；—如機(jī)械加工時(shí)改變了受試物的組成成分，還要提交加工后受試物組成成分的檢測(cè)分析的結(jié)果；—制備試驗(yàn)空氣所用設(shè)備和制備動(dòng)物染毒試驗(yàn)空氣操作的描述（可以用示意圖表示）；—所用化學(xué)分析方法的詳細(xì)描述和分析方法的可靠性的詳細(xì)描述（包括從空氣媒介樣品中受試物的回收率）；—設(shè)定選擇試驗(yàn)濃度的理由和根據(jù)。結(jié)果：—列表表示染毒裝置內(nèi)空氣環(huán)境的溫度、濕度和流速；—列表表示染毒空氣中計(jì)算濃度、實(shí)際濃度數(shù)據(jù)；—列表表示顆粒粒徑大小的數(shù)據(jù)，包括樣本的采集測(cè)試方法、粒徑大小的分布、MMAD及幾何標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算等；—列表表示動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的數(shù)據(jù)和每只動(dòng)物暴露濃度水平（如死亡、正常、嚴(yán)重程度和作用的持續(xù)時(shí)間等毒性體征的動(dòng)物數(shù)量）；—試驗(yàn)中收集到的每只動(dòng)物的體重、計(jì)劃試驗(yàn)結(jié)束人道處死前動(dòng)物死亡的日期和時(shí)間、毒性體征出現(xiàn)的時(shí)間和過程，以及每只動(dòng)物出現(xiàn)的毒性體征是否是可逆的等；—每只動(dòng)物大體解剖和組織病理學(xué)檢查（如果進(jìn)行了組織學(xué)檢查）所見；—受試物按照急性吸入毒性（GHS）分類屬于哪類和LC50界限值。討論和結(jié)果分析：—需要特別強(qiáng)調(diào)的是所有方法的描述要達(dá)到本方法規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，如限度濃度試驗(yàn)和顆粒粒徑大小的規(guī)定；—應(yīng)根據(jù)總體調(diào)查結(jié)果處理顆粒的可吸入性，尤其是當(dāng)無法滿足顆粒尺寸標(biāo)準(zhǔn)時(shí)；—從整個(gè)試驗(yàn)所見可知制備受試物達(dá)到可呼吸性粒徑是至關(guān)重要的，要特別注意是不是未能達(dá)到顆粒粒徑大小的標(biāo)準(zhǔn)；—對(duì)測(cè)定計(jì)算濃