人細(xì)小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白對啟動子的調(diào)控及其出核轉(zhuǎn)運機(jī)制研究

人細(xì)小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白對啟動子的調(diào)控及其出核轉(zhuǎn)運機(jī)制研究人細(xì)小病毒B19(HumanParvovirusB19,HPVB19),簡稱B19病毒,屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae),紅細(xì)胞病毒屬(Erythrovirus),是目前為止僅有的兩種能感染人類的細(xì)小病毒科成員之一。B19病毒作為一種重要病原,能感染兒童及成年人并引起一系列的疾病,感染孕婦則會導(dǎo)致胎兒貧血、流產(chǎn)及胎兒水腫。隨著社會生活水平及人們疾病預(yù)防知識的提高,對于該病毒的研究已經(jīng)越來越受到人們的重視。目前國內(nèi)對于該病毒的研究主要局限于分子流行病學(xué)及其診斷方面,對于該病毒致病機(jī)制的分子生物學(xué)方面報道較少。本研究選擇了B19病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、11kDa、7.5kDa及X蛋白為研究對象,希望通過研究B19病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對病毒啟動子及細(xì)胞內(nèi)因子啟動子的調(diào)控作用以及非結(jié)構(gòu)蛋白的出核轉(zhuǎn)運機(jī)制,為揭示B19病毒非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒侵染細(xì)胞途徑及其復(fù)制中的作用提供理論基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容包括以下兩個方面：(1)人細(xì)小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白對p6啟動子和細(xì)胞內(nèi)因子啟動子的調(diào)控作用B19病毒的轉(zhuǎn)錄由單一的p6啟動子調(diào)控,通過選擇性的剪切和選擇性的多腺苷酸化生成12個病毒mRNA轉(zhuǎn)錄物。和其它細(xì)小病毒成員一樣,p6啟動子的活性受細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Spl/3,YY1,hGABP等的調(diào)控。本實驗中我們通過分析預(yù)測,在p6啟動子的上游存在三個ATF/CREB結(jié)合基序及一個E2F結(jié)合位點,該區(qū)域?qū)τ趐6啟動子活性的影響還沒有相關(guān)報道。通過檢測綠色熒光蛋白表達(dá)和熒光素酶活性定性并定量研究該區(qū)域?qū)幼踊钚缘挠绊?結(jié)果顯示預(yù)測的ATF/CREB結(jié)合位點能夠影響p6啟動子在Hela細(xì)胞內(nèi)的活性,而潛在的E2F結(jié)合位點對p6啟動子活性影響不大。同時,通過比較p6啟動子、CMV啟動子在不同非敏感細(xì)胞系中的活性,顯示p6啟動子在不同非敏感細(xì)胞系中均具有較高的活性,但均低于CMV啟動子的活性。同時軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒科成員均存在潛在的CpG島,而CpG島的體外甲基化修飾能抑制p6啟動子的活性。由于B19病毒NS1蛋白對p6啟動子及某些細(xì)胞內(nèi)基因啟動子具有激活的功能,而其它非結(jié)構(gòu)蛋白是否具有類似的功能還未知。我們利用熒光素酶報告檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)11kDa蛋白不能反式激活p6啟動子的活性；而x蛋白則如NS1蛋白一樣可以上調(diào)p6啟動子的活性;并且其上調(diào)啟動子活性的DNA效應(yīng)元件區(qū)域為其3’端78個堿基,即nt.265-343區(qū)域(含有3個潛在的ATF/CREB結(jié)合位點、1個EBS基序以及一個Spl/3結(jié)合位點),而該區(qū)域與NS1蛋白上調(diào)p6啟動子活性的DNA效應(yīng)元件區(qū)域一致。雖然11kDa蛋白不能上調(diào)p6啟動子的活性,卻能顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)TNF-α,IL6,STAT3啟動子的活性；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),11kDa蛋白對IL6啟動子活性的上調(diào)依賴于NF-κB信號途徑,主要通過降解細(xì)胞內(nèi)IκBa,誘導(dǎo)p65入核,進(jìn)而激活I(lǐng)L6啟動子的表達(dá)。(?)人細(xì)小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白定位及出核轉(zhuǎn)運機(jī)制研究細(xì)小病毒成功侵染宿主細(xì)胞后,在細(xì)胞核內(nèi)完成病毒基因組的復(fù)制、病毒粒子的包裝。為了避免宿主細(xì)胞凋亡及宿主細(xì)胞天然免疫保護(hù)反應(yīng)的影響,細(xì)小病毒在長期進(jìn)化的過程中演化出一種優(yōu)先機(jī)制,即在細(xì)胞衰亡之前完成核輸出轉(zhuǎn)運。目前大量研究發(fā)現(xiàn),許多病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白通過與細(xì)胞內(nèi)出核轉(zhuǎn)運受體蛋白CRM1相互作用,執(zhí)行自身的核質(zhì)轉(zhuǎn)運,進(jìn)而在介導(dǎo)病毒RNA、蛋白質(zhì)乃至病毒粒子的出核過程中起作用。由于B19病毒NS1及11kDa蛋白的缺失會降低其感染性,并且11kDa蛋白的缺失導(dǎo)致病毒衣殼蛋白的核集聚,因此,我們推測B19病毒非結(jié)構(gòu)蛋白,尤其是11kDa蛋白可能具有介導(dǎo)病毒粒子出核的功能。本實驗中我們主要探究了B19病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NSl、11kDa及7.5kDa蛋白的細(xì)胞定位及其出核轉(zhuǎn)運機(jī)制,發(fā)現(xiàn)前兩者具有依賴于CRM途徑的出核轉(zhuǎn)運過程,同時利用哺乳動物雙雜交實驗證實NSl及11kDa蛋白能夠與CRM1發(fā)生相互作用,通過系列的截短及定點突變確定了分別影響其出核轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵氨基酸位點。然而對7.5kDa蛋白的研究則發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞質(zhì)定位不依賴于CRM1途徑,并且進(jìn)一步的細(xì)胞組分及激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),該蛋白主要定位于線粒體中；通過截短及定點突變確定了決定其亞細(xì)胞定位的關(guān)鍵氨基酸位點。關(guān)于B19病