SN 1199-2003棉花中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢 測(cè) 方 法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)棉花中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR2003-03-17發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)天津出入境檢驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了抗鱗翅目昆蟲(chóng)棉花中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction(PCR)3.3.4dATP:deoxyadenosinetriphosphate,脫氧腺苷三磷酸。3.3.5dCTP:deoxycytidine3.3.7dTTP:deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸。23.3.10EDTA.ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺3.3.12Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羥甲基)氨基甲烷。3.3.14CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。3.3.17CryIA(b)-CryIA(c):asyntheticgeneencodes608aminoacids,productidenticaltothatofcryIA(b)geneandcryIA(c)geneofBacillusthuringiensissubsp,Kursta3.3.18CrylA(c):asyntheticgeneencodesinsecticidal-activetruncatedproductidenticaltothatofcrylA(c)geneofBacillusthuringiensissubsp,KurstakisteainHD-73蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)毒蛋白4防污染措施5抽樣和制樣6測(cè)定方法6.1原理濃度為5pmol/L。其中外源基因的有關(guān)信息參見(jiàn)附錄A。被檢測(cè)基因基因來(lái)源引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度/bp退火溫度/℃內(nèi)源5'-tct-gcc-cta-tca-act-tte-gat-ggt-a-3'51-aat-ttg-cgc-gcc-tgc-tgc-ctt-cct-t-3外源5-get-cct-aca-aat-gcc-atc-a-3'5'-gat-agt-ggg-att-gtg-cgt-ca-3'3表1(續(xù))被檢測(cè)基因基因來(lái)源引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度/bp退火溫度/℃外源外源外源外源外源6.2.21mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0):稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris),溶于800mL水6.2.30.5mol/LEDTA(pH8.0):在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉6.2.5CTAB沉淀液：稱取5.0gCTAB,2.3376g氯化鈉，加水溶解定容至1L,分裝后高壓滅菌6.2.11·70%乙醇。6.2.12TE緩沖液(pH8.0):量取10mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)和2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加水定容至1L,分裝后高壓滅菌備用。6.2.1310×PCR緩沖液：含500mmol/L氯化鉀(KCl),100mmol/LTris-HCl(p氯化鎂(MgCl?),0.1%明膠。6.2.2150×TAE緩沖液：稱取484gTris,量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA6.4.1.2加入1.3mLDNA抽提緩沖液，渦旋震蕩30s后，顛倒混合5min(注意不要使樣品結(jié)塊),6.4.1.3室溫10000g離心10min,取上層溶液800μL,加入5μLRNaseA(10μ6.4.1.4加入等體積的三氯甲烷/異戊醇(24:1),顛倒混勻1min。6.4.1.5室溫10000g離心10min,取上清液600μL,加入2倍體積的CTAB6.4.1.6室溫8000g離心10min,棄上清液。6.4.1.7加入800μL氯化鈉(NaCl)(1.2mol/L)溶解沉淀，待沉淀溶解后室溫放置5min,加入等體6.4.1.8室溫10000g離心10min,取上清液600μL,移入1.5mL的Eppendorf管中，加入0.6倍體6.5提取物純度和濃度測(cè)定樣品DNA用核酸蛋白分析儀測(cè)定260nm和280nm5 (2)為空白對(duì)照。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花中內(nèi)外源基因采用的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。每個(gè)反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置兩個(gè)次序50pL反應(yīng)體系加樣體積/pL加樣體積/μL110×PCR緩沖液210×dNTPs(各2.5mmol/L,含dUTP)310X氯化鎂(25mmol/L)4Tag酶(5U/μL)5正義引物(5pmol/L)6反義引物(5μmol/L)7DNA模板(0.1μg/μL～1.0μg/μL)8加水至注：反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。表3檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花內(nèi)外源基因的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)被擴(kuò)增的內(nèi)外源基因變性擴(kuò)增條件循環(huán)次數(shù)最終延伸CryIA(b)-CryIA(c)注：PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)可根據(jù)不同的基因擴(kuò)增儀進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。6.6.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)分析用電泳緩沖液(1×TBE或TAE)制備2%瓊脂糖凝膠(55℃~60℃時(shí)加入左右加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/mL,也可在電泳后進(jìn)行染色)。取9μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加1μL10×上樣緩沖液上樣。電泳時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按上述上樣量上樣，并在每行膠孔中選一個(gè)膠孔，在其中加DNA分子量標(biāo)記物混合液以判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小。電壓大小一般控制在3V/cm～5V/cm,電泳時(shí)間根據(jù)PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及溴酚藍(lán)的移動(dòng)位置來(lái)確定，電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。6用針對(duì)真核生物內(nèi)源基因18SrDNA基因設(shè)計(jì)的引物對(duì)棉花DNA提取液進(jìn)行PCR測(cè)試，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)樣品都應(yīng)被擴(kuò)增出137bp的PCR產(chǎn)物。如未見(jiàn)有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則說(shuō)明DNA提取液質(zhì)量有問(wèn)題，或DNA提取液中有抑制PCR反應(yīng)的因子存在，應(yīng)重新提取DNA,直到擴(kuò)增出137bp7.2結(jié)果判定對(duì)棉花樣品DNA提取液進(jìn)行外源基因的PCR測(cè)試，如果陰性對(duì)照和空白對(duì)照未出現(xiàn)條帶，陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)樣品均出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶(擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1),則可初步判定待測(cè)樣品中含有可疑的該外源基因，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行確證試驗(yàn)，依據(jù)確證試驗(yàn)的結(jié)果最終報(bào)告；如果待測(cè)樣品中未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則可判斷待測(cè)樣品中不含有該外源基因。使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)應(yīng)檢測(cè)目的基因以排除假陽(yáng)性的可能。確證試驗(yàn)方法按照SN/T1204中規(guī)定的方法執(zhí)行。8結(jié)果表述8.1未檢出××××基因。(資料性附錄)轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)入的外源基因的有關(guān)信息表A.1