小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編過程中p53、MDM2、Aurka基因相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編過程中p53、MDM2、Aurka基因相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究目的:研究攜帶有轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的腺病毒感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFc),通過誘導(dǎo)出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC),并分析在重編程過程中p53基因、MDM2基因、Aurka基因的變化規(guī)律,為提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)效率提供思路。方法:1.對前期凍存的MEFc進(jìn)行復(fù)蘇,待MEFc生長良好后,加入帶有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(OSCK)的腺病毒,反復(fù)感染兩次后,觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;2.對誘導(dǎo)出的細(xì)胞進(jìn)行多能性鑒定:通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、成瘤性、堿性磷酸酶(偶氮偶聯(lián)法)染色,及干細(xì)胞標(biāo)志基因檢測;3.將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別按照誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后24h、誘導(dǎo)后1w、誘導(dǎo)后2w四個(gè)時(shí)間段,利用Real-TimePCR技術(shù),多次測量p53基因、MDM2基因、Aurka基因的轉(zhuǎn)錄情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各個(gè)基因內(nèi)各個(gè)時(shí)間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。結(jié)果:1.對誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行多能性鑒定:a、形態(tài)學(xué)變化:可觀察到細(xì)胞邊界輪廓清楚,胞體較小鼠成纖維細(xì)胞變大,變圓,長度變短,少數(shù)呈多變性,仍有明顯突起,但突起長度變短。b、成瘤性觀察:約7-8周后可見到大鼠根部明顯2-3個(gè)畸胎瘤,用手觸及包塊質(zhì)中等硬度,可滑動,與周圍組織無粘連,表面光滑。取出包塊組織,可見到包塊淡紅色塊橢圓形柱狀物,大小為約1cm×0.5cm×0.3cm。將取下的組織行切片、HE染色處理,可見細(xì)胞核成藍(lán)色,胞質(zhì)成粉紅色,在中可見到大量杯狀細(xì)胞組成的腺體組織、血管、大量的脂肪組織。c、堿性磷酸酶鑒定:可見大量堿性磷酸酶陽性顆粒。d、干細(xì)胞標(biāo)志基因檢測:Oct4、Sox2及Nanog在誘導(dǎo)的細(xì)胞中均有表達(dá)。2.在誘導(dǎo)過程中p53轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律:1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w、轉(zhuǎn)染后2w比較,相對表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后兩周比較,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后兩周比較,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p53的轉(zhuǎn)錄在四因子腺病毒轉(zhuǎn)染后24h既出現(xiàn)升高,在轉(zhuǎn)染1w后較高,而在轉(zhuǎn)染2w后出現(xiàn)下降。在誘導(dǎo)過程中MDM2轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律:1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w、轉(zhuǎn)染后2w比較,RQ差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后兩周比較,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后兩周比較,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MDM2的轉(zhuǎn)錄在四因子腺病毒轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)下降,1w時(shí)下降明顯,而在轉(zhuǎn)染2w后卻出現(xiàn)升高。與p53基因的變化規(guī)律成反比。在誘導(dǎo)過程中AURKA轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律:1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w,RQ差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與轉(zhuǎn)染后2w比較,RQ差異不顯著(P>0.05)。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后2w比較,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后2w比較,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？烧J(rèn)為Aurka的轉(zhuǎn)錄在四因子腺病毒轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)明顯升高,1w時(shí)較轉(zhuǎn)染后仍高,而在轉(zhuǎn)染2w呈現(xiàn)與正常水平,且Aurka的轉(zhuǎn)錄升高水平明顯高于p53基因。通過利用MDM2與Aurka的抑制劑發(fā)現(xiàn)細(xì)胞p53蛋白表達(dá)均明顯升高。結(jié)論1.細(xì)胞的重編程過程能夠激活p53信號通路,p53轉(zhuǎn)錄在轉(zhuǎn)染2w后出現(xiàn)下降,考慮重編程已經(jīng)完成,可考慮干預(yù)重編程過程的時(shí)間在2w內(nèi)。2.細(xì)胞重編程過程中MDM2水平下降,通過利用MDM2拮抗劑在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)明顯增加,可以通過對MDM2-p53信號通路的作用,影響誘