幾種布魯菌抗原的免疫學(xué)特性研究

幾種布魯菌抗原的免疫學(xué)特性研究布魯菌(Brucella)是布魯菌病(Brucellosis)的病原體。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)布魯菌有7個生物種:羊布魯菌(B.melitensis)、牛布魯菌(B.abortus)、豬布魯菌(B.suis)、犬布魯菌(B.canis)、綿羊布魯菌(B.ovis)、鼠布魯菌(B.neotomae)和海洋哺乳動物布魯菌(B.maris)。各種間具有高度的同源性,但在毒力、生物學(xué)性狀以及感染人類或畜類后的臨床表現(xiàn)和流行特征等方面存在差異。其中既可以感染畜類也可以感染人類的生物種有羊、牛、豬和犬布魯菌。在我國流行的主要有羊、牛和豬布魯菌三種,且以羊布魯菌最為常見,其致病力也最強(qiáng)。布魯菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌,感染后可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫可清除細(xì)胞內(nèi)布魯菌,在抗布魯菌感染免疫中占主要地位?，F(xiàn)有的布魯菌疫苗為滅活疫苗和減毒活疫苗,在一定程度上對于疫情的預(yù)防和控制起到積極作用,但是也存在一些問題:(1)滅活疫苗雖然可以起到一定的保護(hù)作用,但是免疫效果比較有限,不能引起足夠的細(xì)胞免疫應(yīng)答;(2)減毒活疫苗由于毒力恢復(fù)反彈而感染動物或人類,其應(yīng)用受到限制;(3)在疫區(qū)篩查檢測時,常用的血清學(xué)方法如試管凝集試驗(yàn)等無法區(qū)分傳統(tǒng)疫苗免疫的動物和受到布魯菌感染的動物,這對于隔離病畜,進(jìn)而防治疫情擴(kuò)散起到制約作用。因此,國內(nèi)外均在進(jìn)行布魯菌新型疫苗包括DNA疫苗的研究。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些具有保護(hù)作用的布魯菌抗原基因,如編碼L7/L12、BCSP31和OMP31等抗原的基因。單獨(dú)的保護(hù)抗原基因雖然可以誘導(dǎo)一定的免疫反應(yīng),起到一定的保護(hù)作用,但是存在保護(hù)效果較差,保護(hù)時間較短等缺陷。因此,研制聯(lián)合多個保護(hù)性抗原基因的DNA疫苗是布魯菌疫苗研究的熱點(diǎn)之一。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,對布魯菌rp1L、omp31、bcsp31、omp22、omp2b等基因進(jìn)行免疫學(xué)分析研究:制備了相應(yīng)的單克隆抗體(monoclonalantibody,mAb);對多個抗原基因的各種組合進(jìn)行了免疫學(xué)分析,以期篩選出最佳的組合方式。1、幾種布魯菌外膜蛋白的表達(dá)、純化及其單克隆抗體的制備構(gòu)建了幾種布魯菌外膜蛋白基因的原核表達(dá)載體,并將其分別命名為pGEX-4T-1-omp31、pGEX-4T-1-omp22、pGEX-4T-1-omp25d、pGEX-4T-1-omp2b。將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌并誘導(dǎo)表達(dá),采用GST親和層析純化的方法,分別獲得純化的布魯菌OMP31、OMP22、OMP25d和OMP2b蛋白。用純化的蛋白檢測布魯菌全菌免疫的BALB/c小鼠血清,取高效價的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞融合,ELISA間接法篩選陽性克隆,3次克隆化后建立雜交瘤細(xì)胞系。采用小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水,正辛酸-硫酸銨法純化mAb。采用Westernblot和ELISA等方法鑒定mAb特性。結(jié)果獲得了2株抗布魯菌OMP22蛋白的mAb,2株抗布魯菌OMP25d蛋白的mAb,2株抗布魯菌OMP31蛋白的mAb以及1株抗布魯菌OMP2b蛋白的mAb。這7株單克隆抗體特異性強(qiáng)、敏感性較好,與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、結(jié)核分枝桿菌和綠膿假單胞菌等無交叉反應(yīng)。2、重組DNA的制備和動物免疫分別構(gòu)建了pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31、pcDNA3.1-bcsp31、pcDNA3.1-omp22和pcDNA3.1-omp2b真核表達(dá)載體。分別用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,其所表達(dá)的蛋白可被兔抗布魯菌血清識別。再將上述質(zhì)粒大量提取和純化,并按照如下方式進(jìn)行組合后分別免疫C57BL/6小鼠,并檢測各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo),以減毒活疫苗M5株和生理鹽水為對照。(1)將pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31三組重組DNA等量混合免疫C57BL/6小鼠,并將這種組合命名為ROB。(2)將pcDNA3.1-omp22和pcDNA3.1-omp2b分別免疫C57BL/6小鼠。(3)將ROB和pcDNA3.1-omp22(命名為Ⅰ4);ROB和pcDNA3.1-omp2b(Ⅱ4);ROB和pcDNA3.1-omp22、pcDNA3.1-omp2b(Ⅲ5)三組分別免疫C57BL/6小鼠。3、重組DNA免疫效果的評價ROB組重組DNA免疫小鼠在末次免疫后4周的抗體水平最高,平均抗體滴度為1:1280(P<0.01);所產(chǎn)生的Th1型細(xì)胞因子如TNF-α和IFN-γ等均比M5株對照組高出2倍以上(P<0.05);所誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于M5株對照組(P<0.05);并具有更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷能力(P<0.05),提示獲得的ROB重組DNA在細(xì)胞免疫水平方面要強(qiáng)于M5疫苗株。布魯菌omp22組和omp2b組均刺激了較高的體液免疫水平(均大于1:1000,P<0.05);在檢測IgG2a/IgG1比值方面,omp22組和omp2b組均優(yōu)于M5組(P<0.05);omp2b組誘導(dǎo)的TNF-α和IFN-γ水平高于M5組(P<0.05);pcDNA3.1-omp2b免疫動物的脾細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后,所產(chǎn)生的IFN-γ的細(xì)胞數(shù)目約是M5組的4倍(P<0.05);CTL殺傷實(shí)驗(yàn)表明,在效靶比為100時,omp2b組的殺傷能力明顯強(qiáng)于M5組(P<0.05)。omp22組的各項(xiàng)指標(biāo)也明顯好于M5組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ⅱ4組所誘導(dǎo)的特異性IgG為1:1280(P<0.05);IgG2a/IgG1比值是2.8(P<0.05)。在細(xì)胞免疫方面,Ⅱ4組誘導(dǎo)的TNF-α和IFN-γ高于M5組(P<0.05);Ⅱ4組免疫小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后能產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)目為64±3.4,高于M5組(P<0.05);CTL殺傷實(shí)驗(yàn)表明,在效靶比為100時,Ⅱ4組的殺傷效果優(yōu)于M5組(P<0.0