昆明地區(qū)產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制研究

昆明地區(qū)產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制研究喹諾酮類(lèi)藥物(Quinolones)是一類(lèi)人工合成的廣譜、強(qiáng)效抗菌藥物,是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗菌藥物。腸桿菌科細(xì)菌(Enterobacteriaceaebacteria)是臨床最常見(jiàn)的分離菌,其中又以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主,近年來(lái)腸桿菌科細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重,常常導(dǎo)致臨床治療延遲或失敗。之前的觀點(diǎn)認(rèn)為腸桿菌科的喹諾酮耐藥是由染色體介導(dǎo)的,包括細(xì)胞膜通透性改變、主動(dòng)外排系統(tǒng)和靶基因的改變?nèi)N途徑。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥(plasmid-mediatedquinoloneresistance,PMQR)途徑,這很好的解釋了耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的問(wèn)題。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)的耐藥基因,包括qnr基因家族和aac(6’)-Ib-cr基因等,常與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases.ESBLs)協(xié)同傳播,且這些基因的分布有地域性差異,研究本地區(qū)質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類(lèi)耐藥機(jī)制研究對(duì)臨床的經(jīng)驗(yàn)性用藥和制定適宜的院感控制措施顯得尤為重要。本文的主要研究工作是昆明地區(qū)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥的機(jī)制,包括以下三個(gè)方面:(1)檢測(cè)PMQR的流行基因2015年5月—2016年7月從云南省第一人民醫(yī)院不同科室、不同年齡段病人,不同感染部位分離出的50株喹諾酮類(lèi)耐藥的產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科細(xì)菌,其中包括26株大腸埃希氏菌和24株肺炎克雷伯菌。設(shè)計(jì)特異的質(zhì)粒耐藥基因引物,對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株提取基因組后,利用PCR技術(shù)檢測(cè)不同菌株質(zhì)粒耐藥基因的攜帶情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌中流行的耐藥基因有所差異,大腸埃希氏菌最流行的是qnrB基因,檢出率高達(dá)88.4%,其次是aac(6’)-Ib-cr基因,檢出率為61.5%,qnrD和qnrS基因都只檢測(cè)到了一例。肺炎克雷伯菌中都攜帶qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib-cr基因,檢出率都為100%。我們還發(fā)現(xiàn)在同一株菌中可能有攜帶幾種不同的質(zhì)粒耐藥基因,大腸埃希氏菌中42.3%菌株攜帶有兩種耐藥基因,7.6%的菌株攜帶有三種耐藥基因。所有的肺炎克雷伯菌都攜帶了三種相同質(zhì)粒耐藥基因。(2)多重耐藥性研究對(duì)攜帶有PMQR基因的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn),大腸埃希氏菌全部接合成功,肺炎克雷伯菌除兩株外,也全部接合成功。這說(shuō)明攜帶有喹諾酮耐藥基因的質(zhì)粒具有很高的水平轉(zhuǎn)移能力,沒(méi)有接合成功的樣品可能是因?yàn)閿y帶耐藥基因的質(zhì)粒缺乏接合相關(guān)的轉(zhuǎn)移操縱子。用E-test的方法檢測(cè)喹諾酮類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)藥物對(duì)接合供體菌、受體菌、接合子的MIC值。我們發(fā)現(xiàn)供體菌和接合子對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物都具有耐藥性,這間接說(shuō)明耐藥基因是位于質(zhì)粒上的。絕大部分的供體菌和接合子對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物有耐藥作用,只有一株E.coli供體菌有耐藥作用,而其接合子對(duì)藥物敏感,說(shuō)明其耐藥基因位于基因組上。供體菌和接合子對(duì)除碳青霉烯類(lèi)外大多數(shù)的β-內(nèi)酰胺藥物耐藥,說(shuō)明質(zhì)粒上同樣攜帶了這些藥物的耐藥基因。綜合這些數(shù)據(jù)我們可以得出攜帶有喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因的質(zhì)粒上,同樣攜帶了氨基糖苷類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥基因,造成了腸桿菌科細(xì)菌的多重耐藥作用。(3)腸桿菌科細(xì)菌同源性分析用脈沖電泳技術(shù)分析攜帶有PMQR基因的腸桿菌科細(xì)菌的同源性,有14株大腸埃希氏菌的同源性為85%以上判定為相同菌株來(lái)源,占到了總數(shù)的58.3%(14/24),其中有一組兩個(gè)菌株的同源性為100%;肺炎克雷伯菌同源性達(dá)到85%以上的菌株有16株,占到了總數(shù)的66.6%(16/24),其中有5組十株基因組條帶完全一致是為近期傳播的同一菌株,占比為41.6%(10/24),這五組菌株中有四組來(lái)自于重癥監(jiān)護(hù)室,說(shuō)明在免疫力低下病人中,這種耐藥菌傳播更迅速。綜合這些數(shù)據(jù)可以得出質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥,在肺炎克雷伯菌中的流行爆發(fā)相對(duì)于大腸埃希氏菌更集中,耐藥菌在免疫力低下病人中傳播更迅速。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在昆明地區(qū)臨床分離腸桿菌科菌中最流行的PMQR基因是qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib-cr,且這些基因水平傳播能力很強(qiáng),攜帶有PMQR基因的質(zhì)粒上同時(shí)