中低頻純音強聲對小型豬生物效應(yīng)的研究

中低頻純音強聲對小型豬生物效應(yīng)的研究背景高聲壓級的可聽聲首先直接作用于聽覺系統(tǒng),然后通過聽覺器官再作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),而且隨著暴露時間的延長,會引起一系列繼發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。對于強聲暴露引起的神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂和損傷,目前的研究結(jié)論多建立在強噪聲暴露的臨床經(jīng)歷和嚙齒類動物模型的實驗基礎(chǔ)上。而對于純音強聲、尤其是中低頻純音強聲的生物效應(yīng)尚研究較少。就強聲暴露對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機理而言,目前的研究主要集中在腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)和相關(guān)受體的合成、釋放和轉(zhuǎn)運等方面。對于影響腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)和相關(guān)受體的機制研究較少,參與介導(dǎo)的信號通路尚未明確闡明。海馬和皮層的神經(jīng)元突觸,如果長時間維持增強的誘導(dǎo)、可導(dǎo)致突觸敏感化,引起神經(jīng)遞質(zhì)含量減少,從而影響正常的神經(jīng)系統(tǒng)的功能。其最為突出的表現(xiàn)是空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降,但是目前強聲暴露對海馬和皮層神經(jīng)元遞質(zhì)及受體的作用機制尚不清楚。因此,本課題以巴馬小型豬為研究對象,系統(tǒng)的觀察了中低頻純音強聲暴露對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的特點,并初步探討了強聲可能致海馬和皮層神經(jīng)元損傷的分子機制,為進一步闡述強聲致神經(jīng)損傷的相關(guān)機理提供了參考。材料和方法實驗動物以巴馬小型豬作為研究對象。所有實驗動物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,飼養(yǎng)條件相同。30只巴馬小型豬隨機分為3組:空白對照組,900Hz-130dB強聲暴露組和900Hz-142dB強聲暴露組?？瞻讓φ战M小型豬不進入強聲實驗現(xiàn)場;130dB強聲暴露組采用900Hz、130dB強聲刺激15min;142dB組采用900Hz、142dB強聲刺激15min。實驗結(jié)束后每組隨機抽取小型豬5只,麻醉后抽取靜脈血10ml,獲取血液后將其處死,取出相同部位的部分海馬和皮層組織,分別存放于液氮和4%的福爾馬林溶液中。每組剩余的小型豬送回實驗動物中心留觀,一周后同法取樣。1、血清生化分析:獲得的靜脈血凝血后2000rpm室溫離心10min,取上層血清,使用全自動血液分析儀對小型豬各血清樣品生化指標(biāo)進行檢測,檢測內(nèi)容包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、a-羥丁酸脫氫酶(a-HBDH)、總膽汁酸(TBA)、超氧化物歧化酶(SOD)、g-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨肽酶(LAP)等。2、血清神經(jīng)內(nèi)分泌激素分析:獲得的血清,按照相應(yīng)激素的檢測試劑盒說明書提供的實驗步驟,采用ELISA方法對血清中不同激素的含量進行檢測。檢測的激素包括促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、血清皮質(zhì)醇(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、去甲腎上腺素(NE)、腦紅蛋白(NGB)、神經(jīng)肽P(NPP)、神經(jīng)肽Y(NPY)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、血清S100-b等。3、腦組織形態(tài)學(xué)觀察:將固定后的組織樣品依次進行梯度脫水、石蠟包埋后進行石蠟切片,切片厚度4μm,切片后進行HE染色,封片后于顯微鏡下觀察并拍照。4、鈣離子濃度分析:OTC包埋組織,冰凍切片機切片,加入Fluo-4進行染色、孵育并清洗后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察鈣離子的熒光信號,使用ZEN2011軟件對鈣離子濃度進行定量分析。5、基因mRNA表達(dá)水平檢測:液氮中冷凍組織經(jīng)研磨后使用Qiagen試劑盒提取總的mRNA,總RNA定量后,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;針對PKC、PI3K和CACNA2D1基因,選用合適的引物,采用Real-timePCR方法定量分析上述基因表達(dá)水平。6、PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)水平檢測:將液氮中凍存冷凍的組織充分裂解后,提取組織蛋白,然后進行蛋白電泳和蛋白轉(zhuǎn)印。PKC和Ca2+受體特異的抗體4℃孵育過夜,洗膜后,二抗室溫孵育60min,最后進行暗室顯影,對PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)進行定量分析。實驗結(jié)果巴馬小型豬分別暴露在900Hz-142dB和900Hz-130dB的中低頻純音強聲條件下15分鐘后均出現(xiàn)明顯的行為異常,表現(xiàn)為:小型豬大部分采取背對強聲發(fā)生裝置的姿勢,出現(xiàn)興奮性增強,局促不安,撞籠等現(xiàn)象,個別小豬出現(xiàn)了小便失禁,無法自主站立或前肢跪下等行為異常反應(yīng),對銳器刺激反應(yīng)不敏感。以上異常行為提示有神經(jīng)系統(tǒng)損傷。900Hz-142dB和900Hz-130dB強聲暴露15分鐘后和暴露后一周血清指標(biāo)顯示:(1)血清中SOD的含量都明顯增加;血清中CK含量都明顯下降;(2)血清中CRP含量都明顯上升,而血清中NE和LDH、CK-MB、ALP、a-HBDH含量都明顯下降;(3)900Hz-130dB強聲暴露15分鐘后血清中CORT和α-HBDH含量下降;900Hz-142dB強聲暴露15分鐘后血清中NSE含量升高,血清中(γ-GT)含量下降;(4)900Hz-142dB強聲暴露一周后血清中NPY和TBA含量上升;此外,短時間的強聲暴露對血清中ACTH、CRH、NGB、NPP、S100-β、LAP的含量沒有明顯的影響。以上結(jié)果提示SOD、NSE和CK有可能作為強聲對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物。小型豬腦組織形態(tài)學(xué)分析:海馬組織HE染色顯示:900Hz-130dB強聲暴露組未見明顯損傷樣改變,900Hz-142dB強聲暴露組可見海馬組織出現(xiàn)明顯的損傷樣改變,部分顆粒細(xì)胞核明顯固縮,細(xì)胞質(zhì)空泡化,椎體細(xì)胞水腫較為明顯,提示這部分細(xì)胞可能已經(jīng)凋亡。小型豬腦組織中鈣離子濃度的定量分析顯示:與空白對照組相比,900Hz-142dB強聲暴露組可見海馬組織中鈣離子濃度明顯增加,而在皮層組織中,鈣離子濃度明顯下降。小型豬腦組織中PKC、PI3K和CACNA2D1基因mRNA表達(dá)水平檢測:與空白對照組相比,900Hz-142dB強聲暴露組海馬組織中PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出現(xiàn)明顯上調(diào);而在皮層組織中,強聲暴露后PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出現(xiàn)明顯下調(diào)。小型豬腦組織中PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)水平檢測:與空白對照組相比,900Hz-142dB強聲暴露組的海馬組織中,PKC和鈣離子受體的表達(dá)明顯增加;而在皮層組織中,PKC和鈣離子受體的表達(dá)明顯下降。結(jié)論綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)900Hz-142dB和900Hz-130dB的中低頻純音強聲暴露15分鐘后,小型豬出現(xiàn)異常行為反應(yīng)。900Hz-142dB和900Hz-130dB強聲暴露組可見血清中部分生化分子和神經(jīng)內(nèi)分泌激素發(fā)生不同程度的變化,其中NSE和SOD明顯升高、CK含量明顯下降,提示SOD、NSE和CK有可能作為強聲對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物。900Hz-142dB短時間的強聲刺激可引起大腦海馬組織損傷樣改變,而皮層組織結(jié)構(gòu)影響未見明顯異常。15分鐘900Hz-142dB中低頻純音強聲刺激作用于海馬組織,通過激活PI3K、PK