GB-T《核酸適體活性評價標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》

ICSFORMTEXT07.080FORMTEXTB20/39中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2017FORMTEXTFORMTEXT核酸適體活性評價標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范FORMTEXTGeneraltechniquerulesforactivityevaluationofaptamerFORMTEXT點擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識FORMDROPDOWNFORMTEXTFORMTEXT-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施GB/TXXXXX—2017核酸適體活性評價標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合的親和力和特異性的評價，確立核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合的專一性和選擇性的方法驗證，建立性能評價的技術(shù)通則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于針對細(xì)胞，大分子，小分子，復(fù)雜靶標(biāo)等不同層次靶標(biāo)體系的核酸適配體。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法SN/T1193基因檢驗實驗室技術(shù)要求術(shù)語和定義核酸適配體(Aptamer)能夠與多種目標(biāo)物（蛋白、藥物、金屬離子、無機(jī)或有機(jī)分子、細(xì)胞、組織）發(fā)生高親和性和特異性結(jié)合的一類單鏈核苷酸（DNA或RNA）分子。平衡解離常數(shù)(disocciationconstant，Kd)是靶標(biāo)物質(zhì)被核酸配體結(jié)合一半時靶標(biāo)物質(zhì)的濃度常數(shù)。操作步驟核酸適配體與靶標(biāo)的結(jié)合能力分析方法測定篩選獲得核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合的平衡解離常數(shù)（Kd），Kd值越小表明兩者相互作用越強(qiáng)。Kd常用測定方法：熒光光譜法：適用于細(xì)胞，大分子，小分子，復(fù)雜靶標(biāo)等。對核酸適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記，稀釋到不同濃度，與相同濃度的靶標(biāo)共混并在合適的條件下孵育，將結(jié)合后的靶標(biāo)與未結(jié)合的核酸適配體分離，使用熒光光譜儀測定核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度與核酸適配體濃度的關(guān)系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Aptamer])，獲得Kd值。流式細(xì)胞術(shù)：適用于細(xì)胞、大分子、小分子等。對核酸適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記，釋到不同濃度；與相同濃度的靶標(biāo)共混并在合適的條件下孵育，將核酸-靶標(biāo)復(fù)合物通過流式細(xì)胞儀，測定帶有熒光標(biāo)記的核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的數(shù)量，繪制其與核酸適配體濃度的關(guān)系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Aptamer])，獲得Kd值。表面等離子共振法：適用于細(xì)胞、大分子、小分子等。將核酸適配體固定于芯片上，稀釋靶標(biāo)到不同濃度，加入不同濃度梯度的靶標(biāo)在合適的條件下孵育后清洗，通過表面等離子共振法設(shè)備測定核酸適配體結(jié)合的靶標(biāo)的數(shù)量，繪制其與靶標(biāo)濃度的關(guān)系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。等溫滴定微量熱法：適用于大分子、小分子等，將核酸適配體和靶標(biāo)進(jìn)行透析處理，選擇適宜的樣品濃度，脫氣處理后，進(jìn)行核酸適配體-靶標(biāo)滴定試驗，同時進(jìn)行對照實驗（滴水試驗，樣品滴定緩沖溶液試驗），所得數(shù)據(jù)經(jīng)過軟件分析即可得到Kd值。酶聯(lián)適配體分析法：適用于細(xì)胞等，將核酸適配體固定于基板上，洗脫后加入不同濃度梯度的靶標(biāo)，孵育后沖洗，再加入帶有熒光標(biāo)記的核酸適配體孵育后洗脫，通過熒光分析儀獲得熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)濃度的關(guān)系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。DNA捕獲元件法：適用于細(xì)胞、大分子、小分子等。將標(biāo)記熒光集團(tuán)和淬滅集團(tuán)的核酸適配體與不同的濃度靶標(biāo)混合，孵育后，檢測熒光強(qiáng)度。繪制熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)濃度的關(guān)系圖。擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。生物膜干涉法：適用于：細(xì)胞、大分子、小分子等。將核酸適配體固定于芯片上與不同的濃度靶標(biāo)混合，孵育后清洗，利用生物膜干涉設(shè)備測定與核酸適配體結(jié)合的靶標(biāo)數(shù)量，繪制其與靶標(biāo)濃度的關(guān)系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。超濾法：適用于細(xì)胞、大分子等。對核酸適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記，釋到不同濃度；與相同濃度的靶標(biāo)共混并在合適的條件下孵育，使用超濾膜過濾，使用熒光光譜儀測定核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度與核酸適配體濃度的關(guān)系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Aptamer])，獲得Kd值。核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合特異性驗證基于4.1的結(jié)果選擇親和力最高（即Kd值最低）的核酸適配體進(jìn)行特異性驗證。選擇靶標(biāo)和幾種靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行測試，使用4.1中介紹的方法分別測量核酸適配體與靶標(biāo)以及幾種結(jié)構(gòu)類似物的親和力（即Kd值）并進(jìn)行比較，獲得特異性結(jié)果。防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)劃起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北食品檢驗研究院等本標(biāo)準(zhǔn)主要起