GB-T《核糖核酸酶活力檢測方法》

GB/TXXXXX–2012GB/TXXXXX–2012IIGB/TXXXXX—201X中華人民共和國國家標準GB/TXXXXX—201X中華人民共和國國家標準ICS07ICS07.080B20/39核糖核酸酶活力測定核糖核酸酶活力測定Determinationoftheactivityofribonuclease（征求意見稿）發(fā)布中國國家標準化管理委員會201X-XX-XX發(fā)布發(fā)布中國國家標準化管理委員會201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施GB/T××××—201×PAGE2核糖核酸酶活力測定1范圍本標準規(guī)定了核糖核酸酶活力測定原理、儀器設(shè)備及器具、主要試劑、分析步驟和結(jié)果分析。本標準適用于生化試劑核糖核酸酶活力測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義3.1核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸核酸的核酸酶。根據(jù)酶作用的位置不同，可進一步分為內(nèi)切核糖核酸酶與外切核糖核酸酶。3.2核糖核酸酶活力單位（ribonucleaseactivityunit）以濃度為0.15mg/mL的1.5ml酵母RNA為底物，在50℃且pH5.0的條件下，1分鐘內(nèi)使反應(yīng)液在260nm處吸光度增加0.001所需要的酶量為一個活性單位（U）。4原理核糖核酸酶催化產(chǎn)物在260nm波長下具有特征吸收峰，通過外標法計算核糖核酸酶的活性。5儀器設(shè)備及器具5.1恒溫水浴槽。5.2紫外-可見分光光度計：吸光度精確至0.001。5.3pH計：精確至0.01。5.41cm石英比色皿。5.5電子天平：精度為0.0001g和0.01g。6試劑本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實驗用水均為GB/T6882規(guī)定的二級水。6.10.1mol/L乙酸/乙酸鈉（NaAc/HAc）緩沖液，pH5.0稱取8.20gNaAc溶于水中，緩慢加入HAc調(diào)pH至5.0，混勻后定容至1000ml。6.2酵母核糖核酸來源于圓酵母（TorulaYeast），含量≥98%。7分析步驟7.1環(huán)境要求所有試驗操作步驟應(yīng)在潔凈的無外源RNA酶環(huán)境中進行。7.2試驗液的制備7.2.1酵母RNA溶液稱取酵母RNA15.0mg溶于水中，使其溶液濃度為0.15mg/mL。7.2.2固體樣品待測酶液制備稱取28.0mg樣品，溶于水中，調(diào)節(jié)核糖核酸酶液初始濃度為0.7mg/mL。7.2.3液體樣品待測酶液制備將液體待測酶樣用水調(diào)節(jié)最后的溶液中核糖核酸酶液濃度為0.7mg/mL。7.3酶促反應(yīng)同一樣本取4只離心管，設(shè)置空白對照管1只，檢測管3只，其中空白管中依次加入酵母RNA溶液1.5mL、水0.5mL與NaAc/HAc緩沖液1.0mL；檢測管中依次加入酵母核糖核酸（RNA）溶液1.5mL、待測酶液0.5mL以及NaAc/HAc緩沖液1.0mL。每個待測酶液設(shè)定三個重復(fù)即3個檢測管，50℃恒溫水浴反應(yīng)時間為15min。7.4分光光度分析空白對照管標記為0號管，檢測管分別標記為1-3號管，加樣方法如表1所示，反應(yīng)后在260nm處測對照管和檢測管溶液的吸光度，并記錄結(jié)果。表1待測樣液加樣方法0號管1號管2號管3號管酵母核糖核酸溶液（mL）1.51.51.51.5水（mL）0.50.00.00.0NaAc/HAc緩沖液（mL）1.01.01.01.0待測酶液（mL）0.00.50.50.58結(jié)果分析8.1酶活力計算按照式（1）計算： （SEQ標準自動公式\*ARABIC1）式中：C：核糖核酸酶活力（U/mL或U/g）；△A260：檢測管與空白對照管在260nm處測定得到的吸收值差；1000：吸光度原值與活力規(guī)定中規(guī)定吸光度0.001的換算系數(shù)。15：反應(yīng)時間與活力單位定義中的換算系數(shù)。以平行樣的平均值為最終的酶活力測定值，計算結(jié)果保留整數(shù)位。8.2重復(fù)性在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位：。本標準主要起草人：。前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位：。本