尼古丁對骨髓間充質干細胞修復關節(jié)軟骨缺損的干預作用及機制研究

尼古丁對骨髓間充質干細胞修復關節(jié)軟骨缺損的干預作用及機制研究關節(jié)軟骨缺損是指累及軟骨表層甚至軟骨下骨的軟骨損傷,可由創(chuàng)傷、退行性變、贅生物、先天性畸形等引起。創(chuàng)傷是導致關節(jié)軟骨缺損的最常見原因,主要是由于運動或意外事故造成。隨著競技體育日趨激烈、交通日益發(fā)達以及人口老齡化問題的日漸突出,使得罹患關節(jié)軟骨缺損的病例不斷增加。由于關節(jié)軟骨缺乏血管神經(jīng)支配的組織學和生物學特性限制了其自我修復能力,軟骨缺損的治療一直是臨床骨科醫(yī)生面臨的難題。關節(jié)軟骨缺損的修復尤其是對較大面積缺損的修復,尚缺乏理想的方法,隨著科學技術的發(fā)展和組織工程學的興起,使關節(jié)軟骨缺損的修復取得了一定的進展。骨髓間充質干細胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells,BMSCs)具有增殖能力強,可多向分化,且采集方便、對機體損傷小的特點,是軟骨組織工程理想的種子細胞。應用BMSCs進行回植誘導分化修復關節(jié)軟骨缺損取得了良好的臨床效果。然而,目前的研究大多集中于如何更有效促進BMSCs的軟骨分化,如何提高BMSCs的軟骨修復效果,對于BMSCs軟骨分化中的不良暴露因素的研究甚少。當前,我國已成為全球最大的煙草生產(chǎn)國,吸煙人口亦居世界第一,因吸煙所致的各種疾病及死亡人數(shù)逐年上升。流行病學研究發(fā)現(xiàn),尼古丁濫用是影響自體軟骨細胞移植修復軟骨缺損臨床效果的不良因素之一,但其是否同樣可影響B(tài)MSCs的軟骨缺損修復尚未見報道。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),尼古丁持續(xù)暴露4周可顯著抑制大鼠BMSCs體外軟骨定向分化中的蛋白多糖合成和軟骨標志基因表達,但其具體機制仍不明確。Y染色體性別決定結構域轉錄因子(SRY-typehighmobilitygroupbox9,Sox9)是軟骨形成的起始因子,在軟骨發(fā)生和發(fā)育過程中與軟骨表型基因的增強子區(qū)結合,促進軟骨表型基因表達并維持軟骨細胞特性。α7煙堿受體(α7nicotinicacetylcholinereceptor,α7-nAchR)是一類存在于MSC中典型的離子通道,可調控胞內Ca2+濃度。鈣調神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CaN)是唯一受Ca2+調控的磷酸酶,其活化可調節(jié)活化的T細胞核因子2(nuclearfactorofactivatedTcell2,NFATc2)的磷酸化狀態(tài),進而調控下游信號通路的功能。表遺傳修飾是指影響基因轉錄活性而不涉及DNA序列改變的基因表達調控方式,其最常見的形式為組蛋白乙?；揎?。組蛋白乙?；癄顟B(tài)主要由組蛋白乙?；揎椕刚{控,與基因的表達調控密切相關,組蛋白乙酰化酶和去乙?；钢g的動態(tài)平衡維持著基因的正常表達。因此,我們認為尼古丁可能通過a7-nAchR調節(jié)Ca2+/CaN/NFAT通路,導致Sox9表遺傳發(fā)生變化,進而影響B(tài)MSCs的軟骨分化。本研究首先從動物水平證實尼古丁對BMSCs修復軟骨缺損的不良干預作用,其機制可能是通過抑制Sox9的表達實現(xiàn)其干預作用。然后在前期研究的基礎上,從細胞水平證實尼古丁通過表遺傳修飾抑制Sox9表達進而影響B(tài)MSCs軟骨分化的分子機制。進一步利用工具藥及RNA干擾技術,闡明尼古丁抑制BMSCs軟骨分化的可能的分子靶標。本研究對于尼古丁依賴人群軟骨缺損臨床治療風險評估,指導個性化治療方案,最大程度上避免尼古丁對BMSCs軟骨修復的不利影響,實現(xiàn)高質量的關節(jié)軟骨組織修復,具有重要的理論和現(xiàn)實意義,同時也為指導軟骨組織工程在臨床中應用提供研究依據(jù)。第一部分尼古丁對大鼠BMSCs修復軟骨缺損的干預作用研究目的：通過大鼠軟骨缺損模型,證實尼古丁對BMSCs軟骨缺損修復的干預作用,該干預作用可能通過抑制Sox9表達實現(xiàn)。方法：全骨髓貼壁法分離提取Wistars大鼠BMSCs,傳代培養(yǎng)至第三代。取12周齡Wistars大鼠40只,雌雄各半,給予10%水合氯醛(3.5ml/Kg)腹腔注射麻醉,于右側股骨滑車處制做直徑3.0mm,深度1.5mm的軟骨缺損模型。將大鼠隨機分為4組：缺損對照組(Non-treated):軟骨缺損造模后未給予任何修復處理；凝膠修復組(Alginate):軟骨缺損造模并海藻酸鈉凝膠修復；凝膠+干細胞修復組(BMSCs):軟骨缺損造模并復合BMSCs的海藻酸鈉凝膠修復；凝膠+干細胞修復+尼古丁處理組(Nicotine):軟骨缺損造模并復合BMSCs的海藻酸鈉凝膠修復,術后每日分2次給予總量為2.0mg/kg的尼古丁皮下注射。術后3月麻醉下處死大鼠并取股骨遠端標本,取部分標本先觀察缺損修復的大體觀并行ICRS評分,后制做切片予以組織病理學檢測,評估缺損修復效果并行組織學評分。免疫組化檢測修復組織中Col2A1、Sox9表達。剩余標本取缺損處修復組織,提取總RNA,PCR檢測軟骨表型基因(Col2A1和Aggrecan)及Sox9表達。結果：大體觀與組織學檢測顯示,缺損對照組可見修復的軟骨組織,深度與周圍軟骨基本平齊,軟骨表面可見明顯的缺損及潰瘍；HE及番紅固綠染色可見修復組織為纖維軟骨樣組織,基質染色明顯變淺。凝膠修復組可見部分修復的軟骨組織,面積為缺損的1/2以上,深度接近周圍正常軟骨,軟骨表面可見較大的裂隙存在；HE及番紅固綠染色未見基質染色,修復組織為非軟骨組織。凝膠+干細胞修復組軟骨缺損完全修復,深度與周圍軟骨平齊；軟骨表明光滑；HE及番紅固綠染色可見其為透明軟骨組織,軟骨基質染色與周圍正常軟骨無差異。凝膠+干細胞修復+尼古丁處理組軟骨缺損基本修復,深度基本與周圍軟骨平齊；軟骨表面未見明顯缺損,部分呈纖維軟骨樣改變；HE及番紅固綠染色可見大部分為透明軟骨樣組織,軟骨基質染色較周圍正常軟骨淺。ICRS評分顯示凝膠+干細胞修復組高于其他組(P<0.05),組織學評分顯示凝膠+干細胞修復組低于其他組(P<0.05)。免疫組化染色顯示,缺損對照組修復組織中Col2A1染色較淡,Sox9陽性染色細胞數(shù)量少；凝膠修復組Col2A1未見染色,未見Sox9陽性染色細胞；凝膠+干細胞修復組染色明顯,Sox9陽性染色細胞數(shù)量較多；凝膠+干細胞修復+尼古丁處理組染色Col2A1也較淡,Sox9陽性染色細胞數(shù)量較少。光密度分析結果表明,凝膠+干細胞修復組Col2A1、Sox9的MOD值較凝膠+干細胞修復+尼古丁處理組高(P<0.01,P<0.05)。軟骨表型基因mRNA表達顯示,凝膠+干細胞修復組Col2A1、Aggrecan及Sox9的mRNA表達均高于凝膠+干細胞修復+尼古丁處理組(P<0.05)。結論：海藻酸鈉凝膠復合BMSCs移植可良好修復軟骨缺損,尼古丁可對其修復效果產(chǎn)生不利影響,不良干預作用可能通過抑制Sox9表達實現(xiàn)。第二部分尼古丁抑制大鼠BMSCs軟骨分化的表觀遺傳轉錄調控機制研究目的：在細胞水平證實尼古丁抑制BMSCs軟骨分化的表觀遺傳轉錄調控機制。方法：采用海藻酸鈉微球三維培養(yǎng)方法,對BMSCs進行軟骨誘導分化28天,分化過程中每日給予不同濃度(0、0.1、1、10、100(?)M)尼古丁處理,PCR檢測軟骨表型基因及Sox9的mRNA表達。取P3代BMSCs,提取蛋白及總RNA,PCR和WesternBlotting篩選驗證煙堿受體(nicotinicacetylcholinereceptor,nAchR)亞型。Fluo-3AM孵育BMSCs,給予上述不同濃度尼古丁處理,激光共聚焦檢測細胞內Ca2+濃度變化的時間與幅度,并采用發(fā)色底物法檢測細胞內CaN活性變化。尼古丁分別處理BMSCs8h、16h及24h,檢測Sox9的表達變化,根據(jù)Sox9的表達發(fā)生變化的時間確定尼古丁處理時間。給予不同濃度尼古丁處理BMSCs驗證其表遺傳機制,提取總蛋白與核蛋白檢測NFATc2表達,提取漿蛋白,檢測磷酸化的NFATc2表達。進一步采用染色質免疫共沉淀方法(chromatinimmunoprecipitation,ChIP)檢測Sox9基因啟動子區(qū)H3K9、H3K14乙?；揎?、NFATc2與Sox9啟動子區(qū)結合以及Sox9與Col2A1增強子區(qū)結合情況,應用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)檢測NFATc2與組蛋白去乙?；?(histonedeacetylase,HDAC1)的相互作用。結果：BMSCs上存在a7-nAChR.給予尼古丁刺激后細胞內Ca2+濃度在5-10min內呈濃度依賴性升高,CaN活性亦呈濃度依賴性增強(P<0.05)。尼古丁處理BMSCs24h后,Sox9表達明顯降低。胞核中去磷酸化的NFATc2表達升高(P<0.01,P<0.05),胞漿中磷酸化的NFATc2表達下降(P<0.01,P<0.05),細胞總蛋白中NFATc2表達無明顯差異。NFATc2與Sox9啟動子區(qū)結合增強(P<0.01,P<0.05),Sox9啟動子區(qū)組蛋白H3K9、H3K14乙?；较陆?P<0.01,P<0.05),Sox9與Col2A1增強子區(qū)結合下降(P<0.01,P<0.05)。HDAC1與NFATc2的結合增強。尼古丁處理導致的以上改變均呈現(xiàn)出濃度依賴性變化的特點。結論：尼古丁對BMSCs軟骨分化抑制的表遺傳調控機制主要是通過α7-nAChR使Ca2+濃度上升并活化CaN,使NFATc2去磷酸化入核,與Sox9啟動子區(qū)結合并招募HDAC1,從而使Sox9啟動子區(qū)乙?；陆狄种芐ox9表達,進而與Col2A1增強子區(qū)結合下降,使軟骨表型基因表達下降從而抑制軟骨分化。第三部分尼古丁抑制大鼠BMSCs軟骨分化的分子靶標研究目的：利用α7-nAChR特異性抑制劑甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine,MLA)及Si-NFATc2在細胞水平確證尼古丁抑制BMSCs軟骨分化的分子靶標。方法：取P3代BMSCs按第二部分方法進行軟骨誘導分化28天,隨機分為4組：對照組(Control):給予正常軟骨分化培養(yǎng)；尼古丁處理組(Nicotine):每日給予100(?)M尼古丁處理；(3)MLA處理組：每日給予10(?)M的MLA處理；(4)MLA+尼古丁處理組：每日先給予MLA處理0.5h,再給予100(?)M尼古丁處理。檢測軟骨表型基因及Sox9的mRNA表達,番紅O和阿利新藍特殊染色進行形態(tài)學檢測。為進一步明確分子機制的作用靶標,將BMSCs分為4組：對照組(Control):給予正常軟骨分化培養(yǎng)24h；尼古丁處理組(Nicotine):給予100(?)M尼古丁處理24h;Si-NFATc2處理組(Si)：先給予Si-NFATc2處理24h,再給予100(?)M尼古丁處理24h;MLA處理組(MLA)：先給予MLA處理0.5h,再給予100(?)M尼古丁處理24h。采用第二部分中方法檢測BMSCs中Ca2+濃度變化、Sox9基因啟動子區(qū)H3K9、H3K14乙酰化修飾、NFATc2與Sox9啟動子區(qū)結合、Sox9與Col2A1增強子區(qū)結合以及HDAC1與NFATc2的結合情況。結果：軟骨誘導分化28天后,與對照組相比,尼古丁處理組軟骨基質阿利新藍及番紅O染色明顯變淺,MLA處理組及MLA+尼古丁處理組基質染色無明顯變化；尼古丁處理組軟骨表型基因及Sox9的mRNA表達明顯下降(P<0.01),MLA處理組及MLA+尼古丁處理組無明顯變化。機制靶標驗證結果顯示,尼古丁組Sox9的mRNA與蛋白表達明顯下降(P<0.01),Sox9表達無明顯變化。尼古丁處理后Ca2+濃度升高,MLA及尼古丁處理后Ca2+濃度無明顯變化。與對照組相比,尼古丁組Sox9啟動子