利用RNA干擾技術(shù)沉默稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶B基因

利用RNA干擾技術(shù)沉默稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶B基因世界上有大半以上的人口將稻米作為主食,水稻作為全球最主要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物之一,病蟲害的防治一直以來都是一件至關(guān)重要的事情。稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)主要以包括水稻在內(nèi)的眾多禾本科植物葉片為食,因此也是對此類農(nóng)作物危險(xiǎn)相當(dāng)嚴(yán)重的害蟲之一。幾丁質(zhì)合成酶(chitinsynthase)是昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)合成通路上至關(guān)重要的一個酶,在昆蟲生長發(fā)育周期中扮演著十分重要的角色,因此這個酶也常被科研工作者作為研究對象。本論文的主要目的是通過RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆并分析稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶B基因(CmCHSB)的全長cDNA序列。再利用植物轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù),獲得對CmCHSB具有明顯抗蟲效果的轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過稻縱卷葉螟取食這種轉(zhuǎn)基因植株后的發(fā)育障礙和致死效應(yīng),從而達(dá)到利用安全有效的生物防治方法來防治稻縱卷葉螟。本研究的主要研究結(jié)果如下:1.稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶B基因的克隆及表達(dá)譜本研究起初運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增出稻縱卷葉螟開放閱讀框部分片段,然后再利用RACE-PCR技術(shù)擴(kuò)增出CmCHSB的全長cDNA。然后將這兩部分所獲得的序列片段拼接得到稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶B基因全長4878bp,開放閱讀框長4578bp,共編碼1525個氨基酸。利用相關(guān)在線軟件對該酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶有17個跨膜結(jié)構(gòu)域,理論等電點(diǎn)為5.89,無信號肽。三級空間結(jié)構(gòu)分析與同源建模結(jié)果顯示,CmCHSB的三維分子空間結(jié)構(gòu)中含6相同數(shù)量的α螺旋和β折疊片,均為6個,沒有發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽序列的存在。氨基酸序列同源性分析結(jié)果表明,CmCHSB的氨基酸序列與亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)CHSB的氨基酸序列一致性有78%,跟其他昆蟲相比同源性是最高的;與煙草天蛾(Manducasexta)和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)CHSB的氨基酸序列一致性都達(dá)到了73%;與其他在NCBI上已經(jīng)公布多種鱗翅目昆蟲CHSB的氨基酸序列一致性均保持在69%以上?；虻臅r空表達(dá)分析結(jié)果顯示,CmCHSB在稻縱卷葉螟整個生長發(fā)育時期以及成蟲各個組織中均發(fā)現(xiàn)有表達(dá),卵期和頭部表達(dá)極低,幾乎檢測不到,成蟲時期和成蟲中腸表達(dá)最高,其表達(dá)模式高低呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。2.注射dsRNA干擾稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶B基因的表達(dá)根據(jù)CmCHSB的全長cDNA序列,設(shè)計(jì)一個相應(yīng)的靶標(biāo)點(diǎn),將其命名為CmCHSB,利用試劑盒在體外合成該基因的dsRNA。用體外顯微注射法導(dǎo)入正常飼養(yǎng)的3齡健康且活性強(qiáng)的幼蟲體內(nèi),以相同的方法設(shè)計(jì)維多利亞多管發(fā)光水母(Aequoreavictoria)綠色熒光蛋白(GFP)的靶標(biāo)點(diǎn)和空白作為對照。采用體外顯微注射法將合成的dsRNA導(dǎo)入幼蟲體內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng),通過不同處理組稻縱卷葉螟對水稻葉片額取食和取食后表型觀察結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測稻縱卷葉螟體mRNA表達(dá)量探索RNA干擾效應(yīng)。在分別注射CmCHSB與GFP的dsRNA48h和72h后,空白組和GFP組水稻葉片被稻縱卷葉螟取食的白條數(shù)明顯多于實(shí)驗(yàn)組(注射dsRNA),兩個對照之間的白條數(shù)卻沒有明顯的差異;隨著時間的推移,兩個對照被稻縱卷葉螟取食越來越嚴(yán)重,而實(shí)驗(yàn)組的取食情況變化不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在對稻縱卷葉螟進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn)以后,其活性及生長發(fā)育受到很嚴(yán)重的抑制作用。在進(jìn)行注射處理7d后,取出直管中存活的稻縱卷葉螟提取RNA后進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測。RT-qPCR結(jié)果顯示,在注射dsRNA7d以后,對比于GFP和空白兩個對照,CmCHSB分別下降了18.11%和37.83%。3.重組RNA干擾植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定根據(jù)稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶B基因的全長cDNA序列設(shè)計(jì)一個400bp大小的靶位點(diǎn),分別將BamHI和SpeI兩個酶切位點(diǎn)添加到該靶標(biāo)位點(diǎn)兩端,然后進(jìn)行人工合成,經(jīng)雙酶切后驗(yàn)證正確后,將其與植物表達(dá)載體p1301進(jìn)行連接,構(gòu)建p1301-CmCHSB*重組植物表達(dá)載體。將構(gòu)建的重組表達(dá)載體經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定,鑒定結(jié)果表明已成功構(gòu)建好重組表達(dá)載體p1301-CmCHSB*,將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體采用液氮凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,以此構(gòu)建基因工程菌。4.轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及室內(nèi)檢測用之前構(gòu)建成功的農(nóng)桿菌EHA105去浸染蜀恢527號秈稻愈傷組織,經(jīng)愈傷組織的抗性篩選、分化和