五氯酚污染土壤的堆肥修復(fù)及其微生物群落組成研究

五氯酚污染土壤的堆肥修復(fù)及其微生物群落組成研究本文采用農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥化處理方式以及添加堆肥的處理方式研究了其對五氯酚污染土壤的生物修復(fù)過程。實驗選用多種理化參數(shù)、生化參數(shù)以及微生物學(xué)參數(shù)評價了土壤中的五氯酚對好氧堆肥化進(jìn)程、堆肥腐熟度以及微生物群落組成的影響；基于這一研究結(jié)果,對比考察了在堆肥化的兩次不同發(fā)酵階段接種P.chrysosporium修復(fù)五氯酚污染土壤的效果,以及其對堆肥中與五氯酚降解有關(guān)的胞外木質(zhì)素降解酶的活性及堆肥中微生物群落組成的影響；最后以腐熟的堆肥以及接種有P.chrysosporium的堆肥作為生物添加材料,研究了采用生物添加法對五氯酚污染土壤的生物修復(fù)效果和對土壤中微生物活性的影響。實驗選用農(nóng)業(yè)廢物稻草秸稈、菜葉、麩皮和土壤作為堆肥原料,設(shè)置了含濃度為133mg/kg的五氯酚污染土壤和未受五氯酚污染土壤的2個堆肥體系。經(jīng)過60d的堆肥化處理結(jié)果表明土壤中五氯酚的降解率達(dá)到了72.3%,堆肥微生物明顯影響了五氯酚的降解速率。通過檢測2個堆體的溫度、pH、有機(jī)質(zhì)含量等多個堆肥參數(shù),發(fā)現(xiàn)五氯酚污染土壤的存在對堆肥化進(jìn)程產(chǎn)生了明顯的影響,并且在堆肥過程的中溫期和高溫期尤為顯著?；诙逊仕形锘蜕瘏?shù)的聚類分析也闡明了2個堆體堆肥化進(jìn)程的區(qū)別,而堆肥溫度是解釋這種差異最相關(guān)的參數(shù)。此外,用碳氮比(C／N)、水溶性有機(jī)碳(WSC)、脫氫酶(DH-ase)活性和種子發(fā)芽指數(shù)(GI)綜合評價了堆肥的腐熟度,研究發(fā)現(xiàn)五氯酚的存在也對腐熟度評價參數(shù)的影響較大。在五氯酚污染土壤的堆肥化處理過程中,堆肥的腐熟度和穩(wěn)定度受污染影響較大,從而使堆肥達(dá)到腐熟的時間延長,堆肥質(zhì)量降低。因此,盡管采用堆肥化處理能夠?qū)崿F(xiàn)五氯酚污染土壤的生物修復(fù)的目的,但是堆肥需要更長的腐熟時間才能達(dá)到好的生物修復(fù)效果。同時,基于分子生物學(xué)方法中的PCR-DGGE技術(shù)考察了堆肥化生物修復(fù)過程中2個堆體微生物群落組成的變化情況。實驗從不同時間獲得的堆肥樣品中提取微生物的總DNA,并選擇細(xì)菌特異性引物對GC-338F/518R和真菌特異性引物對NS1/GC-Fung分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了堆肥中細(xì)菌和真菌群落組成的DGGE圖譜。經(jīng)過圖譜分析以及相關(guān)數(shù)據(jù)的主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)土壤中的五氯酚對堆肥中微生物群落的演替具有較大的影響。在五氯酚污染的脅迫作用下堆肥中的細(xì)菌群落和真菌群落組成發(fā)生改變。其中,五氯酚對堆肥細(xì)菌群落的影響主要表現(xiàn)在堆肥化過程的高溫期,此時2個不同堆體中細(xì)菌群落組成差異極其顯著,但隨著堆肥化的進(jìn)行細(xì)菌群落組成開始變得逐漸相同,尤其當(dāng)堆肥達(dá)到腐熟時2個堆體中相同的細(xì)菌群落組成可以考慮作為評價堆肥腐熟的一項微生物學(xué)指標(biāo)。與細(xì)菌群落的變化相比,堆肥中的真菌的豐度、群落組成由于受五氯酚的濃度影響較大,在其脅迫作用下真菌群落的演替趨勢隨著堆肥化的進(jìn)行變化顯著,直到堆肥達(dá)到腐熟時,2個堆體中真菌群落組成的差異仍然存在。這也表明在五氯酚污染土壤的堆肥化修復(fù)過程中,真菌群落對于評價五氯酚的污染程度比細(xì)菌群落更加有效。本研究另外設(shè)計了3個五氯酚污染土壤的農(nóng)業(yè)廢物堆肥化處理體系,通過在堆肥化過程的兩次不同發(fā)酵階段接種P.chrysosporium,以期能夠進(jìn)一步提高堆肥化生物修復(fù)五氯酚污染土壤的效率。實驗結(jié)果表明,兩次不同發(fā)酵階段的接種方式能夠明顯促進(jìn)土壤中五氯酚的降解,使60d五氯酚總的去除率分別達(dá)到88.6%(RunB)和97.5%(RunC),并能使堆肥提前達(dá)到腐熟。其中在堆肥二次發(fā)酵階段接種P.chrysosporium比在堆肥一次發(fā)酵階段接種對五氯酚的降解效果以及對堆肥腐熟的促進(jìn)程度更加明顯,這表明2種不同的接種方式對五氯酚污染土壤的堆肥修復(fù)效率取決于接種時間。盡管接種P.chrysosporium明顯增強(qiáng)了堆肥中與五氯酚降解有關(guān)的孢外木質(zhì)素降解酶木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP)的活性,但是結(jié)果也發(fā)現(xiàn)幾種酶并不是促使土壤中五氯酚降解最為關(guān)鍵的因素。而基于PCR-DGGE方法的研究結(jié)果也表明,在堆肥的不同發(fā)酵階段接種P.chrysosporium能夠明顯影響細(xì)菌群落的豐度及其群落組成,這種影響在二次發(fā)酵階段接種的堆體中(RunC)表現(xiàn)地更加突出,認(rèn)為微生物群落組成的改變可能是促使五氯酚迅速降解和堆肥化修復(fù)效率顯著提高的主要原因。堆肥是堆肥化過程的終產(chǎn)物,利用堆肥作為生物添加材料通常能夠增加土壤有機(jī)質(zhì)的含量以及微生物的活性,改善土壤的結(jié)構(gòu)和功能。研究添加堆肥或者添加堆肥+接種P.chrysosporium的處理方法對五氯酚污染土壤的生物修復(fù)過程,結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤中五氯酚的濃度隨著處理時間的延長逐漸降低。通過從土壤的3種腐殖質(zhì)組分中提取到的五氯酚的濃度表明,五氯酚在土壤中的消失與土壤的有機(jī)物質(zhì)含量密切相關(guān),添加堆肥的處理方式(CS50)增加了土壤中的有機(jī)質(zhì)含量,從而使土壤中被提取出的五氯酚濃度降低。在添加堆肥+接種P.chrysosporium的處理體系中(CPS50)提取到的五氯酚是所有處理體系中濃度最低的,表明接種P.chrysosporium能夠降解或轉(zhuǎn)化被土壤有機(jī)物質(zhì)吸附的五氯酚,使五氯酚污染土壤達(dá)到了更好的生物修復(fù)效果。而且,研究還發(fā)現(xiàn)2種不同的生物添加處