巴倫葛茲類芽孢桿菌和米黑根毛霉的幾丁質(zhì)酶生化性質(zhì)研究

巴倫葛茲類芽孢桿菌和米黑根毛霉的幾丁質(zhì)酶生化性質(zhì)研究幾丁質(zhì)酶在生物防治、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和功能性低聚寡糖生產(chǎn)等領(lǐng)域具有廣大的運用,一直受到高度關(guān)注。巴倫葛茲類芽孢桿菌是一株嗜熱海洋細(xì)菌,以幾丁質(zhì)作為誘導(dǎo)物時能分泌多種胞外幾丁質(zhì)酶。本文主要研究和討論了產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物的篩選及鑒定,發(fā)酵條件優(yōu)化,以及天然幾丁質(zhì)酶的純化和生化性質(zhì)。此外,還研究了兩種重組幾丁質(zhì)酶的克隆表達(dá)、性質(zhì)及相關(guān)應(yīng)用,論文主要結(jié)論如下:（1）從中國南海海水樣中篩選獲得一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌CAU904,通過形態(tài)學(xué)觀察、16SrDNA序列比對及生理生化實驗鑒定為巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacilusbarengoltzii）。使用不同的碳源、氮源、溫度、初始pH、表面活性劑以及發(fā)酵時間的單因素優(yōu)化試驗取得最佳發(fā)酵條件為:0.5%（w/v）膠體幾丁質(zhì),0.2%（w/v）酵母浸提物,0.1%（w/v）吐溫-80,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0,45℃下培養(yǎng)72h。其最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件在優(yōu)化后發(fā)酵條件下,巴倫葛茲類芽孢桿菌最大產(chǎn)酶水平提高至8.2UmL-1,比優(yōu)化前提高了5.4倍。幾丁質(zhì)酶的酶譜結(jié)果分析顯示,該菌株可以產(chǎn)生多達(dá)11種幾丁質(zhì)水解活性的同工酶。從巴倫葛茲類芽孢桿菌CAU904發(fā)酵酶液中純化獲得一個分子量為67.0kDa的幾丁質(zhì)酶,命名為PbChi67,該酶屬于糖苷水解酶第18家族。其最適pH為3.5,且在較寬廣的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定;最適反應(yīng)溫度為60℃,具有較好的熱穩(wěn)定性。該酶具備嚴(yán)格的底物特異性,只對幾丁質(zhì)類底物存在活性。其水解幾丁質(zhì)聚合物最終產(chǎn)物為幾丁單糖及幾丁二糖,表明該酶為內(nèi)切型的幾丁質(zhì)酶。（2）從巴倫葛茲類芽孢桿菌中克隆到一個18家族幾丁質(zhì)酶基因（PbChi74）。該序列含有一個2,163bp的開放閱讀框,編碼720個氨基酸。通過Ni-IDA親和層析一步純化得到電泳級純蛋白,純酶的分子量為74.6kDa。PbChi74的最適溫度為65℃,在60℃條件下保溫30min仍然穩(wěn)定。在65、70、75和80℃下的半衰期分別為211.7、144.0、79.7和35.2min,最適pH為4.5,在pH4.0-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。而且該酶具有良好的底物特異性,可以有效降解膠體幾丁質(zhì)和乙二醇幾丁質(zhì),比活力分別為19.9Umg-1和22.2Umg-1PbChi74還能夠降解pNP-NAG底物,比酶活力達(dá)到6.4Umg-1,表明該酶同時具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性。幾丁質(zhì)酶PbChi74水解特性表明水解初期只有幾丁二糖產(chǎn)生,顯示PbChi74為外切型幾丁質(zhì)酶。PbChi74還能水解幾丁寡糖（聚合度2-5）,水解終產(chǎn)物均為N-乙酰氨基葡萄糖。當(dāng)幾丁質(zhì)酶PbChi74與-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase）協(xié)同水解膠體幾丁質(zhì)時,幾丁單糖由最初的11.3mgmL-1增加至27.8mgmL-1。HPLC檢測到N-乙酰氨基葡萄糖為唯一的酶解產(chǎn)物,此時轉(zhuǎn)化率達(dá)到92.6%。膠體幾丁質(zhì)經(jīng)過酶法水解,生物轉(zhuǎn)化獲得的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)率達(dá)到86.1%。（3）從嗜熱真菌米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）CAU432中克隆獲得一個新型幾丁質(zhì)酶基因,命名為RmChi44?；騌mChi44含有一個1,284bp的開放閱讀框,編碼427個氨基酸。該基因編碼的氨基酸序列與來源于綠僵菌（Metarhiziumacridum）（M.a.XP₀07810721）的糖苷水解酶18家族幾丁質(zhì)酶相似性最高,為50%。RmChi44在大腸桿菌中成功表達(dá),經(jīng)過Ni-IDA一步純化獲得純酶,純化倍數(shù)為3.3,回收率為40.9%。SDS和凝膠色譜柱檢測到蛋白分子量分別為44.6kDa和44.7kDa,表明該酶天然狀態(tài)下為單亞基蛋白。酶學(xué)性質(zhì)測得該酶的最適pH為4.5,最適溫度為50℃。底物特異性測定顯示能夠降解膠體幾丁質(zhì)和乙二醇幾丁質(zhì),對pNP-NAG和幾丁二糖有一定的活性,但對幾丁質(zhì)粉末和殼聚糖活性較低。RmChi44具有良好的抑菌性能,對植物病原真菌例如綠色木霉（Trichodermaviride）,刺盤孢菌（Col