丘腦網(wǎng)狀核內(nèi)部亞核團(tuán)在丙泊酚全麻過程中的作用及機(jī)制研究

丘腦網(wǎng)狀核內(nèi)部亞核團(tuán)在丙泊酚全麻過程中的作用及機(jī)制研究研究背景及目的:經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn),全身麻醉藥丙泊酚于1989年正式上市,是具有里程碑意義的事件。自此丙泊酚憑借其起效快、無蓄積、恢復(fù)迅速等優(yōu)勢(shì),在臨床上廣泛應(yīng)用。目前世界范圍內(nèi)每年有上千萬例外科手術(shù)在丙泊酚麻醉下進(jìn)行。丙泊酚已成為臨床應(yīng)用最為廣泛且不可或缺的全身靜脈麻醉藥物。然而和其他全麻藥一樣,丙泊酚的麻醉作用機(jī)制至今仍然不清楚。揭示全麻機(jī)理是神經(jīng)科學(xué)和麻醉學(xué)的夢(mèng)想。2005年《Science》雜志主編DonaldKennedy將全麻機(jī)理列為學(xué)術(shù)界今后100年面臨的125個(gè)世紀(jì)難題之一[1],攻破該堡壘亦將成為神經(jīng)科學(xué)和麻醉學(xué)領(lǐng)域里程碑式的飛躍。全麻引起的可逆性意識(shí)消失作為大腦的特殊非生理狀態(tài),與學(xué)習(xí)記憶、睡眠覺醒等大腦高級(jí)功能息息相關(guān)[2]。近年來越來越多的研究結(jié)果支持全麻藥物的作用機(jī)制并非以往認(rèn)為的——麻醉藥物對(duì)大腦整體的非特異性廣泛抑制,而是由各解剖位置、功能特點(diǎn)不同的神經(jīng)回路構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)協(xié)同參與麻醉藥物引起的大腦功能可逆性改變[3-4],即麻醉藥物通過作用于特定大腦區(qū)域,阻斷不同腦區(qū)的功能聯(lián)系,打破信息在高級(jí)中樞的正、負(fù)反饋平衡而發(fā)揮麻醉作用。Ying的研究提示丘腦網(wǎng)狀核(thalamicreticularnucleus,TRN)在丙泊酚的全麻機(jī)理中發(fā)揮了重要作用[5]。然而,丙泊酚是否以及如何作用于TRN并產(chǎn)生麻醉作用仍然不清楚。TRN在大腦信息調(diào)控中的地位極其特殊。它由GABA能抑制性神經(jīng)元組成,調(diào)控丘腦-皮層環(huán)路,是網(wǎng)狀上行激動(dòng)系統(tǒng)的一部分。自2011年起,陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道通過光遺傳、電生理等技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRN內(nèi)部存在不同的功能性子網(wǎng),即TRN各個(gè)亞核團(tuán)的GABA能神經(jīng)元投射至丘腦及皮層的不同區(qū)域并發(fā)揮不同的生理作用[6]。由于TRN特殊的解剖位置、生理功能,并且和睡眠、覺醒、意識(shí)等大腦功能密切相關(guān),啟發(fā)并促使我們探索它在麻醉這個(gè)無知覺、無意識(shí)、類似而有別于睡眠的特殊非生理狀態(tài)中所起的作用。本課題致力于探索TRN內(nèi)部亞核團(tuán)參與丙泊酚發(fā)揮麻醉作用的具體分子、細(xì)胞、網(wǎng)絡(luò)及行為機(jī)制,為丙泊酚中樞麻醉的網(wǎng)絡(luò)學(xué)說及相關(guān)核團(tuán)定位提供新的依據(jù)和方向。研究方法:(1)使用鵝膏蕈氨酸分別對(duì)TRN各亞核團(tuán)進(jìn)行化學(xué)性毀損,檢測(cè)核團(tuán)毀損后大鼠對(duì)丙泊酚麻醉的反應(yīng)及敏感性改變。(2)利用即刻表達(dá)基因C-Fos和GAD-67免疫熒光共標(biāo)檢測(cè)TRN頭端(anteriorthalamicreticularnucleus,aTRN)和TRN尾端(posteriorthalamicreticularnucleus,pTRN)的GABA能神經(jīng)元在清醒、丙泊酚麻醉、麻醉復(fù)蘇三個(gè)階段的功能狀態(tài)。(3)通過分子免疫學(xué)方法驗(yàn)證丙泊酚的主要分子靶點(diǎn)GABAa受體β3亞基(GABAareceptor-β3subunit,GABAaR-β3)在TRN各亞核團(tuán)中的存在和分布。(4)在大鼠雙側(cè)aTRN處注射GABAa受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline,BIC)阻斷該受體,觀察其行為改變。待大鼠狀態(tài)平穩(wěn)后,檢測(cè)其對(duì)丙泊酚麻醉的反應(yīng)及敏感性改變。(5)制備針對(duì)GABAaR-β3的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)病毒,下調(diào)aTRN處GABAaR-β3的表達(dá)。免疫印跡法驗(yàn)證病毒干擾效果。待病毒起效后檢測(cè)大鼠對(duì)丙泊酚麻醉的反應(yīng)及敏感性改變。研究結(jié)果:(1)TRN各亞核團(tuán)被化學(xué)性毀損后,僅aTRN毀損組大鼠對(duì)丙泊酚的敏感性有明顯且持續(xù)的提高(1)aTRN毀損組大鼠相較于對(duì)照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后翻正反射消失(lostofrightingreflex,LORR)的時(shí)間縮短并維持該狀態(tài),即aTRN毀損組大鼠對(duì)丙泊酚的敏感性有明顯且持續(xù)的提高;aTRN毀損組大鼠對(duì)性質(zhì)不同的靜脈麻醉藥物(右美托咪定)的敏感性無明顯變化。(2)pTRN毀損組大鼠相較于對(duì)照組大鼠接受丙泊酚及右美托咪定靜脈泵注后LORR時(shí)間均無明顯變化。(2)aTRN與pTRN的GABA能神經(jīng)元在清醒、麻醉和復(fù)蘇三個(gè)階段呈現(xiàn)相反的功能狀態(tài)(1)aTRN的GABA能神經(jīng)元在清醒時(shí)活躍,而在丙泊酚麻醉后處于相對(duì)抑制狀態(tài)。(2)pTRN的GABA能神經(jīng)元在丙泊酚麻醉后被明顯激活,而撤藥蘇醒后則處于相對(duì)抑制狀態(tài)。(3)aTRN和pTRN均表達(dá)丙泊酚作用靶點(diǎn)GABAaR-β3且aTRN的表達(dá)量較pTRN更為豐富且密集(1)采用免疫印跡法驗(yàn)證抗GABAaR-β3抗體的特異性并使用該抗體檢測(cè)GABAaR-β3在aTRN、pTRN、丘腦、海馬、皮層等腦組織的表達(dá)。結(jié)果顯示aTRN和pTRN區(qū)域均存在GABAaR-β3的蛋白表達(dá)。(2)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,GABAaR-β3在aTRN和pTRN均有一定分布;在相同視野下,GABAaR-β3在aTRN的表達(dá)量較pTRN更為豐富且密集。(4)拮抗aTRN的GABAaR及下調(diào)aTRN處GABAaR-β3的表達(dá)使大鼠對(duì)丙泊酚敏感性下降(1)大鼠雙側(cè)aTRN處注射GABAa受體拮抗劑BIC阻斷該受體,動(dòng)物即刻行為活躍,活動(dòng)度明顯增加。(2)BIC注射組大鼠相較于對(duì)照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后LORR時(shí)間明顯延長(zhǎng),即BIC注射組大鼠對(duì)丙泊酚敏感性下降。(3)針對(duì)GABAaR-β3的siRNA病毒下調(diào)aTRN處該蛋白的表達(dá),病毒干擾組大鼠較對(duì)照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后LORR時(shí)間明顯延長(zhǎng),即病毒干擾組大鼠對(duì)丙泊酚敏感性下降。結(jié)論:aTRN的神經(jīng)元被化學(xué)性毀損后,動(dòng)物對(duì)丙泊酚的敏感性有顯著且持續(xù)的提高,而毀損其它部位則無類似變化。這提示aTRN極有可能參與丙泊酚對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮麻醉作用的過程。C-Fos和GAD-67免疫熒光共標(biāo)發(fā)現(xiàn)aTRN與pTRN的GABA能神經(jīng)元在清醒、麻醉、復(fù)蘇三個(gè)階段顯示出相反的功能狀態(tài),表明TRN各亞核團(tuán)在丙泊酚麻醉過程中發(fā)生了不同的功能變化。BIC阻斷aTRN的GABAaR后動(dòng)物即刻表現(xiàn)出亢奮狀態(tài),即aTRN的GABA能神經(jīng)元興奮性升高使動(dòng)物呈現(xiàn)與麻醉相反的行為學(xué)表現(xiàn)。BIC注射組相較于對(duì)照組,大鼠對(duì)丙泊酚敏感性下降。推測(cè)一方面aTRN處的GABAaR可能是丙泊酚的作用靶點(diǎn),其被拮抗劑阻斷后使丙泊酚麻醉效能降低;另一方面aTRN的GABA能神經(jīng)元興奮性升高可能對(duì)抗丙泊酚的麻醉作用。免疫熒光結(jié)果顯示GABAaR-β3在aTRN處相較于pTRN有著更為豐富且密集的表達(dá),在形態(tài)學(xué)角度支持aTRN作為丙泊酚麻醉神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)核團(tuán)的特殊性。利用siRNA病毒下調(diào)GABAaR-β3的表達(dá),病毒干擾組大鼠相較于對(duì)照組大鼠對(duì)丙泊酚敏感性下降。進(jìn)一步證明aTRN處的GABAaR-β3對(duì)丙泊酚發(fā)揮麻醉作用至關(guān)重要。綜上所述,我們推測(cè)丙泊酚極有