日本囊對蝦中抗菌肽分子基因克隆及功能分析

日本囊對蝦中抗菌肽分子基因克隆及功能分析在無脊椎動物中,由于其缺少傳統(tǒng)意義上的適應性免疫,先天免疫系統(tǒng)在宿主對抗病原體的反應中發(fā)揮著非常重要的作用?？咕?antimicrobialpeptides,AMPs)在先天免疫防御中發(fā)揮著效應分子的作用,可以直接殺死或清除病原微生物。在本論文中,我們以日本囊對蝦為材料,對抗菌肽家族(含WAP結構域蛋白和抗脂多糖因子)中的成員進行了研究,得到以下結果：1.日本囊對蝦含單一單一乳清酸性蛋白(WAP)結構域的抗菌肽的功能研究甲殼動物中含單一乳清酸性蛋白結構域(asinglewheyacidicproteindomain,SWD)的抗菌肽屬于Ⅲ型甲殼肽,具有蛋白酶抑制活性或抑菌活性。然而它在甲殼動物體內的功能尚未被闡述。在本論文中,我們在日本囊對蝦中擴增得到一種SWD抗菌肽,稱為MjSWD。MjSWD的全長為522bp,開放閱讀框編碼一條含24個氨基酸信號肽的蛋白。組織分布結果顯示,MjSWD在血細胞、心、肝胰腺、鰓、胃和腸組織中均有表達,qRT-PCR分析其表達模式表明,對蝦受到鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和白斑病毒的刺激后MjSWD在鰓和胃中表達量上調。純化的重組蛋白MjSWD可以通過結合細菌表面的肽聚糖結合革蘭氏陽性菌和陰性菌,并且可以抑制絲氨酸蛋白酶活性,如枯草桿菌蛋白酶A、蛋白酶K,還可以抑制細菌分泌的蛋白酶活性。與重組蛋白孵育過的鰻弧菌在自然感染的情況下對日本對蝦的感染能力明顯低于對照組,說明MjSWD在對蝦抗細菌免疫中發(fā)揮著重要的作用。2.日本囊對蝦一種新型抗脂多糖因子的功能研究抗脂多糖因子(ALF)是甲殼動物中具有廣譜抗菌活性的效應分子,在對蝦中已發(fā)現(xiàn)四類抗脂多糖因子(ALF-A—ALF-B)。我們在日本囊對蝦中得到一類新型抗脂多糖因子,命名為MjALF-E。E組中含有兩條新型抗脂多糖因子,MjALF-E1和MjALF-E2。組織分布分析表明MjALF-E1主要在血細胞、心臟和小腸中高表達,而MjALF-E2主要表達在鰓、胃和小腸中,并且二者在受到細菌刺激后轉錄水平上都有所提高。重組表達的重組蛋白rMjALF-E2對細菌表面的多糖LPS和PGN表現(xiàn)出較弱的結合活性,人工合成的兩種抗脂多糖因子的LPS結合的結構域多肽對細菌表面的多糖LPS和PGN有較強的結合活性。而且合成的多肽和重組表達的rMjALF-E2對革蘭氏陰性菌有抑制活性。體內實驗表明,MjALF-E2可以幫助體內弧菌清除。通過RNA干擾的方式敲降MjALF-EZ的表達,然后感染鰻弧菌,相對于對照組對蝦的累計死亡率明顯升高。綜上所述,MjALF-E2在對蝦抵抗細菌侵染的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。3.日本囊對蝦中具有抗病毒的抗脂多糖因子(MjALF-D2)的功能研究抗脂多糖因子(ALF)的廣譜抗菌活性在很多甲殼動物中都有報道,近幾年還發(fā)現(xiàn)其具有抗病毒活性,但具體的抗病毒機理還不清楚。在本研究中,我們構建了日本囊對蝦的9種抗脂多糖因子的重組表達載體,進行了重組表達與純化。將純化得到的重組蛋白與白斑綜合征病毒(WSSV)孵育注射到對蝦體內,分析對蝦體內WSSV的復制,結果得到一種具有抗毒活性的抗脂多糖因子MjALF-D2。RT-PCR分析其在日本囊對蝦各組織中的表達情況,MjALF-D2在除肝胰腺外的各組織中均有所分布,在鰓和胃組織中表達量最高。白斑病毒刺激后不同時間段的表達模式分析結果表明,在受到病原刺激后MjALF-D2表達量明顯上調。體內實驗結果表明：注射重組蛋白和白斑病毒的實驗組對蝦體內病毒的含量明顯低于對照組對蝦；相反的,通過注射雙鏈RNA將MjALF-D2干擾掉后,對蝦體內的病毒復制率升高。因此,體內感染白斑病毒的實驗證明了MjALF-D2的抗毒活性。重組蛋白M