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關(guān)于蛋白表達(dá)及純化Part1:蛋白表達(dá)、純化第2頁,共52頁,2024年2月25日,星期天蛋白表達(dá)流程目的基因cDNA表達(dá)宿主載體設(shè)計(jì)引物連接轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達(dá)蛋白純化鑒定保存第3頁,共52頁,2024年2月25日,星期天
gene第4頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Cell-freeBacterialYeastInsectMammalianHost第5頁,共52頁,2024年2月25日,星期天ExpressionSystemCharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoublingtimerapid(30min)rapid(90min)slow(18-24hrs)slow(24hrs)costofgrowthmediumlowlowhighhighexpressionlevelhighlow–highlow–highlow–moderateproteinfoldingrefoldingmayberequiredrefoldingmayberequiredproperfoldingproperfoldingN-linkedglycos.nohighmannosesimple,nosialicacidcomplexO-linkedglycos.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationnoyesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesprojectcostlowlowmiddlehigh第6頁,共52頁,2024年2月25日,星期天一:大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序,共有4405個(gè)開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素(endotoxin)第7頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Vector第8頁,共52頁,2024年2月25日,星期天二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成一個(gè)良好的大腸桿菌表達(dá)載體:復(fù)制起點(diǎn)(ori)多克隆位點(diǎn)。篩選標(biāo)記(抗菌素抗性基因、Tag、篩選標(biāo)記)控制和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細(xì)胞中表達(dá),它的編碼結(jié)構(gòu)必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動(dòng)子有效控制下。第9頁,共52頁,2024年2月25日,星期天可使外源基因高水平表達(dá)的最佳啟動(dòng)子必須具備以下幾個(gè)條件1)強(qiáng)啟動(dòng)子,外源基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上2)應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3)應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,能通過簡(jiǎn)單的方式,使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)。常用的大腸桿菌表達(dá)載體啟動(dòng)子:
λ噬菌體的PL啟動(dòng)子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動(dòng)子色氨酸操縱子trp啟動(dòng)子
pBR322質(zhì)粒的beta-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子啟動(dòng)子第10頁,共52頁,2024年2月25日,星期天終止子a:如果在克隆基因編碼區(qū)的3
末端之后,接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子,便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀過位于下游另一個(gè)啟動(dòng)子b:如果在啟動(dòng)子的上游部位放置一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那么由該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的克隆基因的轉(zhuǎn)錄便會(huì)被限制在最低本底水平。c:轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平。d:在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí),通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。e:大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當(dāng)其后連上一個(gè)U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止效率便會(huì)得到進(jìn)一步加強(qiáng)第11頁,共52頁,2024年2月25日,星期天轉(zhuǎn)譯起始序列a:mRNA的5
末端之獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,是決定mRNA轉(zhuǎn)譯起始效率的主要因素。b:在構(gòu)建外源基因的高效表達(dá)載體時(shí),需認(rèn)真選擇有效的轉(zhuǎn)錄起始序列。c:未鑒定出通用有效的轉(zhuǎn)譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)(KOZAKSEQUENCE)第12頁,共52頁,2024年2月25日,星期天篩選標(biāo)記:其編碼產(chǎn)物可被快速測(cè)定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結(jié)構(gòu)(重組質(zhì)粒)是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞同任何一種目的啟動(dòng)子連接,其表達(dá)活性可作為檢測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)。β-半乳糖苷酶基因lacZ熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)Tag-第13頁,共52頁,2024年2月25日,星期天第14頁,共52頁,2024年2月25日,星期天目的基因保護(hù)堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護(hù)堿基第15頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Xgene引物的設(shè)計(jì):設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。上游、下游引物引入酶切位點(diǎn)oligo6RNA提?。篢RNzol(附件)RT-PCR:附件1:DNAmarker;2:X基因擴(kuò)增產(chǎn)物圖1.1X基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物第16頁,共52頁,2024年2月25日,星期天GenecloningYourdestinationvectorR1R2YourlinearizedvectorX基因R1R2+1.雙酶切目的基因和載體及切膠回收:附件目的基因保護(hù)堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護(hù)堿基2.連接轉(zhuǎn)化:附件3.雙酶切鑒定:附件4.測(cè)序:附件1:DNAmarker;2:重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切;3:空質(zhì)粒pET28a雙酶切圖1.3重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切鑒定圖1.4X基因發(fā)生點(diǎn)突變(AGU→AGC),但為同義突變(Ser)第17頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Proteinexpression
檢測(cè)該重組質(zhì)粒在BL21中是否能被誘導(dǎo)表達(dá),并確定在不同IPTG濃度和時(shí)間蛋白誘導(dǎo)效率的差異。挑單克隆菌落于7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)管中,37C振蕩培養(yǎng)過夜(8-16h)。37C,1mMIPTG終濃度誘導(dǎo)蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml離心管中,于OD600=0.4-0.6(1:100接種,37C培養(yǎng)時(shí),細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600=0.4-0.6約需2h)時(shí)加入終濃度為1mM的IPTG。誘導(dǎo)前在37C培養(yǎng)的菌液中取1ml未誘導(dǎo)的對(duì)照,按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1mlOD600為0.4的菌加40ulbuffer)加入2×上樣緩沖液,混勻,-20℃保存或直接上樣。根據(jù)蛋白分子量大小配置相應(yīng)濃度的SDS膠。(50KD蛋白10%或12%)誘導(dǎo)3-4h后收集菌液,取1ml樣品,測(cè)OD600,10000rpm,1min離心去上清后加入相應(yīng)體積的2×上樣緩沖液,vortex。將收集的菌液在水中煮5min,上樣10μl,120V電壓走濃縮膠,加電壓至150V進(jìn)入分離膠電泳,直到染料剛好走到膠底。取下膠,考馬斯亮藍(lán)染色至少30min(染液若是新配的,染20min就夠了),脫色液脫色。若急需看到結(jié)果,可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。第18頁,共52頁,2024年2月25日,星期天IPTGinductionEvenintheabsenceofIPTG,thereissomeexpressionofT7RNApolymerasefromthelacUV5promoter.Thedegreeoftoxicitywillvaryfromproteintoprotein.pETsystemmanual,Novagen,11thEdition第19頁,共52頁,2024年2月25日,星期天1:蛋白marker;2~9:分別用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)0、1、2、3、4、6、8、12h。圖1.6X蛋白表達(dá)條件:誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化1:0mmol/L;2:0.25mmol/L;3:0.5mmol/L;4:0.75mmol/L;5:1.0mmol/L;6:1.5mmol/L;7:2.5mmol/L;8:3.5mmol/L;9:5.0mmol/L。圖1.5X蛋白表達(dá)條件:IPTG濃度優(yōu)化X蛋白在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化第20頁,共52頁,2024年2月25日,星期天ProteinPurificationCharacterizefunction,activity,structureUseinassaysRaiseantibodiesmanyotherreasons...第21頁,共52頁,2024年2月25日,星期天GuidelinesforproteinpurificationDefineobjectivesDefinepropertiesoftargetproteinandcriticalcontaminantsMinimizethenumberofstepsUseadifferenttechniqueateachstepDevelopanalyticalassaysAdaptedfrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第22頁,共52頁,2024年2月25日,星期天BasicschemeofproteinpurificationFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第23頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Proteinpreparation,extraction,clarificationCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第24頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Proteinisolation,concentration,andstabilizationReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第25頁,共52頁,2024年2月25日,星期天FractionalprecipitationofproteinsAddPrecipitant,CentrifugationChromatographyPrecipitatecontaminantsPrecipitateproteinofinterestDiscardsupernatant,ResuspendproteinDiscardpelletAddPrecipitant,Centrifugation,Discardsupernatant,Resuspendprotein第26頁,共52頁,2024年2月25日,星期天IntermediatePurificationLiquidchromatography(lowerresolution,lowercost)From:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第27頁,共52頁,2024年2月25日,星期天AnintroductiontoliquidchromatographyProteinsolutionappliedtoacolumnColumn=solidporousmatrix(stationaryphase)+liquid(mobilephase)ProteinsseparatedbasedondifferinginteractionswithstationaryandmobilephasesMobilephaseconditionscanbeadjustedtoincreaseordecreaseaffinityofproteinforstationaryphase(gradient)第28頁,共52頁,2024年2月25日,星期天SizeexclusionchromatographyBiggerProteinsSmallerProteins第29頁,共52頁,2024年2月25日,星期天AffinityChromatography第30頁,共52頁,2024年2月25日,星期天AffinityChromatographyMostcommonly-usedchromatographytechniqueCanbeusedonproteinwithnaturalligandsOfteninvolvescovalentattachmentofaffinitytagtoproteinBecauseofuniquetag,providesrapid,specificcleanupinonechromatographystep*Canallowforautomationofproteinpurification第31頁,共52頁,2024年2月25日,星期天PopularSmallAffinityTagsTagMatrixElutingAgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA,Talon,CobaltimidazoleorlowpH5-15HHHHHnativeordenaturing;inexpensiveresinFLAGanti-FLAGantibodylowpHorEDTA/EGTA8DYKDDDDKhighspecificity;harshelutioncond.StrepIImodifiedstreptavidindesthiobiotin8WSHPQFEKexpensiveresinS-peptideS-proteinenzymaticcleavage15KETAAAKFERHMDSdetectionpossible;expensiveresin第32頁,共52頁,2024年2月25日,星期天PopularLargeAffinityTagsTagMatrixElutingAgentSizeNotesMBPamylosemaltose40kDasolubility+secretionenhancer;inexpensiveresinGSTglutathionereducedglutathione26kDainexpensiveresincellulose-bindingdomainscellulosewaterorGd?HCl4-20kDasecretionenhancercalmodulin-bindingpeptidecalmodulinEDTA/EGTA4kDadetectionpossible;expensiveresinHis-patchthioredoxinNi2+-NTA,Talonimidazole11.7kDasolubility+S-Senhancer第33頁,共52頁,2024年2月25日,星期天鎳柱親和層析詳細(xì)步驟:附件第34頁,共52頁,2024年2月25日,星期天1:空質(zhì)粒未誘導(dǎo);2:空質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo);3:細(xì)菌裂解液上清(可溶部分);4:細(xì)菌裂解液沉淀(不可溶部分);(B)切膠回收1:蛋白marker;2:重組質(zhì)粒未誘導(dǎo);3:重組質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo);4:空白孔;5:純化重組蛋白;
(C)Ni柱親和層析:1-8為依次的蛋白過柱洗脫液圖1.7X蛋白的可溶性分析(A)和純化(B、C)蛋白純化結(jié)果1.親和層析柱2.切膠回收(附件)可溶性蛋白o(hù)r包涵體純化第35頁,共52頁,2024年2月25日,星期天PolishingstepsFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACLiquidchromatography(higherresolution,highercost)第36頁,共52頁,2024年2月25日,星期天BasicschemeofproteinpurificationLiquidchromatography(higherresolution,highercost)Liquidchromatography(lowerresolution,lowercost)ReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第37頁,共52頁,2024年2月25日,星期天TagRemovalNH2–proteintaglinkerDDDDKproteaseconsiderations:effectonstructureeffectonfunctionflexibilityprotein1°sequenceCurrentstrategiesfortheuseofaffinitytagsandtagremovalforthepurificationofrecombinantproteinsProteinExpressionandPurification
Volume48,Issue1,July2006,Pages1-13第38頁,共52頁,2024年2月25日,星期天ProteindetectionmethodsSDSVisualconfirmationWesternblotUVSpectrophotometryAbsorbance@280nmDuemostlytoTrp[Protein]calculatedwithBeer’sLawColorimetricTechniquesColorchangeproportionalto[protein]Bradford,Lowry,BCAJ.S.C.OlsonandJohnMarkwell.
CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.291:未加IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;2:IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;3:空白孔;4:純化后的重組蛋白圖1.8重組蛋白的Westernblot分析26kDa1243Anti-6×Hisantibody第39頁,共52頁,2024年2月25日,星期天FinalstepsinpurificationCheckpuritybydetectionmethodsConcentrateyourproteinPrecipitationCentriconsSmallcolumnwithhighbindingcapacityChooseastoragebufferandstorageconditionsConsiderintendeduseofproteinStabilizingadditivesFlashfreezeproteinandstoreat-80oCConfirmidentityofpurifiedproteinMassspectrometrysequencingAnalyticalassays第40頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Helpfulreferencesandguides附件:Protein_Expression_Protocol_3th.docpETsystemmanual,Novagen,11thEditionAmershamBiosciences“Proteinpurificationhandbook.”18-1132-29,EditionAC.GotofollowingURLanddownloadpdfofProteinPurificationHandbook:AffinityPurification:Arnau,J.,Lauritzen,C.,Petersen,G.E.,Pedersen,J.Prot.Expr.Purif.48(2006)1-13.J.S.C.OlsonandJohnMarkwell.CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.29第41頁,共52頁,2024年2月25日,星期天Part2:抗體制備、應(yīng)用
第42頁,共52頁,2024年2月25日,星期天單抗制備多抗制備:附件抗體鑒定效價(jià)特異性第43頁,共52頁,2024年2月25日,星期天PrincipleofMcAbProduction第44頁,共52頁,2024年2月25日,星期天抗原經(jīng)FCA或FIA充分乳化后免疫家兔。首次免疫佐劑用FCA,第二、三次用FIA。家兔脊柱兩旁選5點(diǎn)皮下注射,每點(diǎn)注攝0.2ml,間隔后2周選不同點(diǎn)注射,每次免疫的抗原量約
350μg/兔。第三次免疫后10天,耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)效價(jià)至少達(dá)到1:16;ELISA效價(jià)達(dá)到105即可放血。最后一次取血采用頸動(dòng)脈放血。新西蘭兔(附件)第45頁,共52頁,2024年2月25日,星期天圖1.9兔多克隆抗體效價(jià)測(cè)定-瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)圖1.10
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