豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測方法

1DBXX/XXXXX—XXXX豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測方法本標準規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測方法的技術(shù)要求。本標準適用于在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實驗室進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒病的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬血清或血漿樣品中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求3縮略語下列縮略語適用于本標準。ELISA：酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay）PRRSV：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）OD：光密度，表示被檢測物吸收掉的光密度（opticaldensity）4原理本方法原理是包被板上包被的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗原，可與待測樣品中的特異性抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶標記的二抗，則形成免疫復(fù)合物，洗滌后，如待測樣品中含有PRRSV抗體，顯色深，為陽性，反之為陰性。5儀器和器材5.1微量可調(diào)移液器：50μL～200μL。5.25mL采血針管5.3冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱。5.4酶標儀5.537℃恒溫培養(yǎng)箱5.6高速臺式離心機（離心范圍0～20000r/min）5.7洗板機5.8離心管：4mL離心管、2mL離心管和1.5mL離心管。2DBXX/XXXXX—XXXX6試劑注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實驗使用的試劑等級均為分析純6.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原包被板。6.2陽性對照：豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性豬血清。6.3陰性對照：無豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體豬血清。6.4酶標復(fù)合物：過氧化物酶標記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體。6.5PBS：磷酸鹽緩沖液（0.01mol/LpH7.4）配制見第A.1章。6.6洗滌液：配制見第A.2章。6.7樣品稀釋液：配制見第A.3章。6.8底物溶液：配制見第A.5章。6.9終止液：配制見第A.6章。7操作步驟注：試驗操作過程中涉及生物安全的注意事項依據(jù)GB19489《實驗室生物安全通用要求》的規(guī)定執(zhí)行。7.1樣品的采集、前處理與存放7.1.1采樣注意事項采集樣品及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。7.1.2采樣工具5mL采血針管和4mL、2mL和1.5mL離心管經(jīng)121±1℃高壓滅菌20min。7.1.3樣品的采集與前處理采集血液，用離心機分離上清血清，血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無污染。試驗前將被檢血清統(tǒng)一編號，并用樣品稀釋液作40倍稀釋。前處理后的樣品密封裝于滅菌離心管內(nèi)，4℃或-20℃保存或立即檢驗。7.2ELISA檢測7.2.1在使用前，所有的試劑盒組份應(yīng)恢復(fù)到18～26℃。試劑應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩混勻。7.2.2取出包被板，加入100μL沒有稀釋的陰性對照和陽性對照，每次檢測各加兩孔；在相應(yīng)的孔中加入100μL已經(jīng)稀釋好的樣品。7.2.3在37℃條件下溫育30min(±1min）。7.2.4將各孔的液體棄入廢液桶，用300μL洗滌液洗滌板孔，共洗滌5次。每次洗滌后應(yīng)棄去孔內(nèi)的液體。在最后一次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液在吸水紙上拍干。7.2.5每孔加入100μL酶結(jié)合物。7.2.6在37℃條件下溫育20min(±1min）。7.2.7重復(fù)步驟7.2.4。7.2.8每孔加入50μL顯色液A和50μL顯色液B（也可顯色液A、B等比例混勻后加100μL）。3DBXX/XXXXX—XXXX7.2.9在37℃條件下溫育10min(±1min）。7.2.10每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。測量并且記錄樣品和對照的OD值（450nm），15min內(nèi)讀值有效。8試驗成立條件與結(jié)果判定8.1試驗成立條件 陰性對照平均值（NCX） 陽性對照平均值（PCX） NCX=(NC1+NC2)/2 PCX=(PC1+PC2)/2 試驗成立判斷標準：PCX-NCX≥0.5；NCX≤0.3。如果試驗無效，試驗中的操作值得懷疑，應(yīng)按照操作說明書重做一次試驗。8.2結(jié)果判定樣品的計算S/P=(樣品－NCX)/(PCX－NCX)如果樣品S/P值＜0.2，樣品應(yīng)判定為抗體陰性。如果樣品S/P值≥0.2，樣品應(yīng)判定為抗體陽性。9檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2-2004的規(guī)定執(zhí)行。10廢棄物處理按照《農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)〈病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范〉的通知》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號)規(guī)定執(zhí)行。4DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）試劑配制A.1磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/LpH7.4）氯化鈉氯化鉀磷酸二氫鉀十二水磷酸氫二鈉蒸餾水A.2洗滌液PBS吐溫-20A.3樣品稀釋液含體積分數(shù)為10%新生豬血清的洗滌液A.4磷酸鹽-檸檬酸緩沖液（pH5.0）檸檬酸十二水磷酸氫二鈉蒸餾水A.5底物溶液0.2g0.2g2.83g加至1000mL1000mL0.5mL3.26g