色譜分析基礎(chǔ)

關(guān)于色譜分析基礎(chǔ)2024/3/312024/3/31一、色譜法的特點(diǎn)、分類和作用

1.概述混合物最有效的分離、分析方法。俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置→色譜分離原型裝置，如右圖。

色譜法是一種分離技術(shù)，試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。其中的一相固定不動(dòng)，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體(氣體或液體)，稱為流動(dòng)相。[動(dòng)畫]第2頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31色譜法

當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。[動(dòng)畫2]與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。

兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)[動(dòng)畫1]第3頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/312.色譜法分類

(1)氣相色譜：流動(dòng)相為氣體(稱為載氣)。按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜第4頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31液相色譜(2)液相色譜：流動(dòng)相為液體(也稱為淋洗液)。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。

離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動(dòng)相。第5頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡(jiǎn)單的色譜方法凝膠色譜法：測(cè)聚合物分子量分布。高效毛細(xì)管電泳:九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。第6頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/313.色譜法的特點(diǎn)(1)分離效率高

復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。(2)靈敏度高

可以檢測(cè)出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。(3)分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。(4)應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。第7頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31二、氣相色譜結(jié)構(gòu)流程1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；9-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測(cè)系統(tǒng)溫控系統(tǒng)第8頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31結(jié)構(gòu)流程第9頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31死時(shí)間(tM)：不與固定相作用的氣體(如空氣)的保留時(shí)間；

調(diào)整保留時(shí)間(tR

＇)：tR＇=tR－tM

三、色譜流出曲線與術(shù)語1.基線

無試樣通過檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。2.保留值

(1)時(shí)間表示的保留值

保留時(shí)間(tR)：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；[動(dòng)畫]第10頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31

(2)用體積表示的保留值

保留體積(VR)：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積(VM)：

VM=tM×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR－VM

第11頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/313.相對(duì)保留值r21組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。第12頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/314.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：(1)標(biāo)準(zhǔn)偏差(

)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。(2)半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354

(3)峰底寬(Y)：Y=4

第13頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31四、色譜分離過程色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的。填充柱色譜:氣固(液固)色譜和氣液(液液)色譜，兩者的分離機(jī)理不同。氣固(液固)色譜的固定相:多孔性的固體吸附劑顆粒。

固體吸附劑對(duì)試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液(液液)色譜的固定相:由擔(dān)體和固定液所組成。

固定液對(duì)試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的分離機(jī)理:

吸附與脫附的不斷重復(fù)過程；氣液色譜的分離機(jī)理：

氣液(液液)兩相間的反復(fù)多次分配過程。第14頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/311.氣相色譜分離過程當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜柱與固定相接觸時(shí)，被固定相溶解或吸附;隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附;揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動(dòng)時(shí)又再次被固定相溶解或吸附;隨著載氣的流動(dòng)，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)地進(jìn)行。[動(dòng)畫]第15頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/312.分配系數(shù)(partionfactor)K

組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度(單位：g/mL)比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。第16頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。第17頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/313.分配比(partionradio)k

在實(shí)際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。3.分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；第18頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/314.容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系

式中β為相比。填充柱相比：6～35；毛細(xì)管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。

VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

VS為固定相體積，對(duì)不同類型色譜柱，VS的含義不同；

氣-液色譜柱：VS為固定液體積；

氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量；第19頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/315.分配比與保留時(shí)間的關(guān)系

滯留因子(retardationfactor)：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子RS也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示：若組分和流動(dòng)相通過長(zhǎng)度為L(zhǎng)的分離柱，需要的時(shí)間分別為tR和tM，則：由以上各式，可得：tR=tM(1+k)第20頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31§1-2色譜理論

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；

(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制；

(兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散)兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；第21頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31

塔板理論的假設(shè)：

(1)在每一個(gè)平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；

(2)將載氣看作成脈動(dòng)(間歇)過程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；

(4)每次分配的分配系數(shù)相同。一、塔板理論-柱分離效能指標(biāo)

1.塔板理論(platetheory)半經(jīng)驗(yàn)理論；將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)(類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程)；[動(dòng)畫]第22頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31

色譜柱長(zhǎng)：L，

虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：保留時(shí)間包含死時(shí)間，在死時(shí)間內(nèi)不參與分配!第23頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/312.有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長(zhǎng)的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tM時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：第24頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/313.塔板理論的特點(diǎn)和不足

(1)當(dāng)色譜柱長(zhǎng)度一定時(shí)，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測(cè)組份在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。

(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組份的分配系數(shù)K相同或相近時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，兩組份的分離效果都不會(huì)太理想。

(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。第25頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31二、速率理論-影響柱效的因素1.速率方程(也稱范.第姆特方程式)

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？第26頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。[動(dòng)畫]第27頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng)

B=2γDg

γ：彎曲因子，填充柱色譜，γ

<1。Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)(cm2·s-1)

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;

(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;

(3)分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑;

(4)擴(kuò)散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。[動(dòng)畫]第28頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31

k為容量因子；Dg、DL為擴(kuò)散系數(shù)。

減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。C·u—傳質(zhì)阻力項(xiàng)

傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即：

C=(Cg+CL)[動(dòng)畫]第29頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/312.載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時(shí)：

傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速

，柱效

。載氣流速低時(shí)：

分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。第30頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/313.速率理論的要點(diǎn)

(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。

(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。

(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。

(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。第31頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31三、分離度

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對(duì)的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學(xué)因素；

區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動(dòng)力學(xué)因素。色譜分離中的四種情況如圖所示：第32頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31討論：色譜分離中的四種情況的討論：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。第33頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31分離度的表達(dá)式：R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%(相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn))。第34頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31令Wb(2)=Wb(1)=Wb(相鄰兩峰的峰底寬近似相等)，引入相對(duì)保留值和塔板數(shù)，可導(dǎo)出下式：色譜分離基本方程第35頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31討論：(1)分離度與柱效

分離度與柱效的平方根成正比，r21一定時(shí)，增加柱效，可提高分離度，但保留時(shí)間增加且峰擴(kuò)展，分析時(shí)間長(zhǎng)。(2)分離度與r21

增大r21是提高分離度的最有效方法，

增大r21的最有效方法是選擇合適的固定液。第36頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31例題1：

在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5。計(jì)算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長(zhǎng)是多少？解：r21=100/85=1.18

n有效=16R2[r21/(r21—1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547(塊)

L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm

即柱長(zhǎng)為1.55米時(shí)，兩組分可以得到完全分離。第37頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31氣相色譜分析儀器與主要組成部件第38頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31氣相色譜儀器第39頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31氣相色譜儀器第40頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/311.載氣系統(tǒng)包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制；常用的載氣有：氫氣、氮?dú)狻⒑?；凈化干燥管：去除載氣中的水、有機(jī)物等雜質(zhì)(依次通過分子篩、活性炭等)；載氣流速控制：壓力表、流量計(jì)、針形穩(wěn)壓閥，控制載氣流速恒定。第41頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/312.進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣器+氣化室；氣體進(jìn)樣器(六通閥)：推拉式和旋轉(zhuǎn)式兩種。試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱；第42頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2024/3/31液體進(jìn)樣器：不同規(guī)格的專用注射器，