《朱記平開(kāi)題報(bào)告》課件

RAS對(duì)禽流感病毒增殖的影響及流感病毒NS1基因eIF4GI結(jié)合區(qū)缺失株對(duì)病毒增殖及細(xì)胞因子影響的研究專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)研究生：朱記平導(dǎo)師：金梅林教授開(kāi)題報(bào)告1整理課件RAS對(duì)禽流感病毒增殖的影響及流感病毒NS1基因eIF4GIRAS蛋白對(duì)禽流感病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的影響2整理課件RAS蛋白對(duì)禽流感病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的影響2整理課件一、研究背景二、研究目的三、研究?jī)?nèi)容四、技術(shù)路線五、工作進(jìn)展3整理課件一、研究背景3整理課件一、研究背景

（一）RAS家族（二）RAS與病毒的潛在關(guān)系4整理課件一、研究背景（一）RAS家族4整理課件（一）RAS家族RAS家族屬于常見(jiàn)的癌基因家族種的一類(lèi)，在正常細(xì)胞中以非激活形式存在，故又稱為原癌基因。主要特點(diǎn)可概括如下：（1）在進(jìn)化進(jìn)程中，基因序列呈高度保守性。（2）它的作用是通過(guò)其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)來(lái)體現(xiàn)的；它們的存在對(duì)正常細(xì)胞不僅無(wú)害，而且對(duì)維持正常生理功能、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化起重要作用，是細(xì)胞發(fā)育、組織再生、創(chuàng)傷愈合等所必需。（3）在某些因素（如放射線、某些化學(xué)物質(zhì)等）作用下，一旦被激活，發(fā)生數(shù)量上或結(jié)構(gòu)上的變化時(shí)，就會(huì)形成癌性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因。5整理課件（一）RAS家族5整理課件ras家族主要包括Hras,Kras,Nras家族成員基因序列差異大，但所編碼的蛋白質(zhì)是P21，位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)面，P21可與GTP結(jié)合，有GTP酶活性，并參與cAMP水平的調(diào)節(jié)。6整理課件ras家族主要包括Hras,Kras,Nras6整理課件Ras蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)如圖所示，當(dāng)GTP水解時(shí)，Ras蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，此改變涉及L4，它含有第61位點(diǎn)，致癌突變有時(shí)在此處發(fā)生。Ras的組成型激活的突變發(fā)生在L1的第12位點(diǎn)。它直接影響到和GTP的結(jié)合。在野生型和癌變型之間的變化限制在這些區(qū)域中，并使Ras產(chǎn)生一種構(gòu)象來(lái)承擔(dān)GTP的水解，這是癌致性的基礎(chǔ)，關(guān)鍵是GTP水解能力。

圖Ras蛋白的晶體結(jié)構(gòu)含有6個(gè)β鏈，4個(gè)α螺旋和9個(gè)連接環(huán)。GTP被L9,L7和L1所包被。從30到40的的效應(yīng)區(qū)是相對(duì)暴露的，而其他的區(qū)域也有暴露的（引自Lewin,2000）7整理課件Ras蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)如圖所示，當(dāng)GTP水解時(shí)，Ras蛋白的構(gòu)（二）RAS與病毒的潛在關(guān)系1、Activated(oncogenic)rasinducesacellularinhibitorofPKR.(Mundschauandet.）Activatedrasisfoundin30%ofallmalignanthumantumors2、TheactivatedformofPKRiscapableofblockingproteinsynthesisthroughitsabilitytohosphorylatethesubunitofeukaryotictranslationfactor2.Thismechanisminhibitsviralreplication.8整理課件（二）RAS與病毒的潛在關(guān)系1、Activated(onc《AGeneticallyEngineeredInfluenzaAViruswithras-DependentOncolyticProperties》《Ras-dependentOncolysiswithanAdenovirusVAIMutant》《Reovirusoncolysis:TheRasRalGEFp38pathwaydictateshostcellpermissivenesstoreovirusinfection》《ActivatedN-RasContributestotheChemoresistanceofHumanMelanomainSevereCombinedImmunodeficiency(SCifi)MicebyBlockingApoptosis‘》9整理課件《AGeneticallyEngineeredInfl二、研究目的通過(guò)研究NRAS蛋白在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)是否有助于禽流感病毒的增殖，進(jìn)而分析禽流感病毒與RAS蛋白之間的相互關(guān)系，并推斷禽流感病毒與細(xì)胞癌癥轉(zhuǎn)化的相互關(guān)系。10整理課件二、研究目的10整理課件三、研究?jī)?nèi)容（一）突變N-RAS基因，獲得N-RAS高表達(dá)細(xì)胞系，并進(jìn)行檢測(cè)（二）病毒感染的觀察以及病毒輸出量測(cè)定，PKR活化的測(cè)定（三）研究IFN與RAS的關(guān)系11整理課件三、研究?jī)?nèi)容（一）突變N-RAS基因，獲得N-RAS高（二）（一）突變N-RAS基因，獲得N-RAS高表達(dá)細(xì)胞系，并進(jìn)行檢測(cè)1、根據(jù)Genebank登陸的人NRAS序列，設(shè)計(jì)NRAS基因開(kāi)放閱讀框（570bp）上下游引物，從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增NRAS開(kāi)放閱讀框基因，定點(diǎn)突變NRAS12位氨基酸密碼子和61位氨基酸密碼子，并連接到真核表達(dá)載體pCDNA3.1+上（1）突變12位密碼子，GGTTGT（2）突變61位密碼子，CAAAAA2、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pCDNA3.1-NRAS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到VERO細(xì)胞內(nèi)，使用NRAS多克隆抗體，Westernblot分析NRAS蛋白表達(dá)情況。12整理課件（一）突變N-RAS基因，獲得N-RAS高表達(dá)12整理課件點(diǎn)突變（1）突變12位密碼子，GGTTGT5’AGCATGTGGTGTTGGGAAAAGC3’5’CACATGCTCCAACCACCACCAGT3’（2）突變61位密碼子，CAAAAA5’GGAAAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGAG3’5’TTCTTTTCCAGCTGTATCCAGTATGTCC3’真核表達(dá)引物，連在pCDNA3.1+上5’GCGGTACCGAAATGACTGAGTACAAACT3’(kpnI)5’TTGCGGCCGCTTACATCACCACACAT3’(NotI)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建KpnINotINRASKpnIKpnINRASKpnINRASKpnINRASKpnINotINRASKpnI13整理課件點(diǎn)突變表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建KpnINotINRASKpnIKpnI（二）病毒感染的觀察以及病毒輸出量測(cè)定，PKR活化的測(cè)定1.以合適MOI病毒量感染293T細(xì)胞和VERO細(xì)胞。2.免疫熒光分析RAS高表達(dá)細(xì)胞和正常細(xì)胞上病毒感染情況。3.病毒感染RAS高表達(dá)和正常細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)收獲上清和細(xì)胞，空斑試驗(yàn)檢測(cè)病毒含量。另外用不同劑量病毒感染細(xì)胞，相同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞病變。4.感染病毒的RAS高表達(dá)細(xì)胞，免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)PKR磷酸化狀態(tài)（鼠抗總PKR抗體和抗磷酸化PKR抗體）。相同的方法檢測(cè)ERK的激活狀態(tài)（抗總ERK1/2抗體和抗磷酸化ERK1/2抗體）14整理課件（二）病毒感染的觀察以及病毒輸出1.以合適MOI病毒量感染2RAS高表達(dá)和不表達(dá)的VERO細(xì)胞，均用IFN-α蛋白孵育，然后用病毒感染，觀察病毒感染情況。（三）研究IFN與RAS的關(guān)系15整理課件RAS高表達(dá)和不表達(dá)的VERO細(xì)胞，均用IFN-α蛋白孵Westernblot分析RAS的活化情況AIV免疫印跡分析PKRERK磷酸化情況收獲上清檢測(cè)病毒輸出量免疫熒光分析細(xì)胞被感染情況轉(zhuǎn)染四、技術(shù)路線pcDNA3.1（+）-Nras轉(zhuǎn)染IFN孵育的VERO293TVERO細(xì)胞感染16整理課件Westernblot分析AIV免疫印跡分析PKR收獲上五、工作進(jìn)展1、已分別成功突變NRAS基因12位密碼子和61位密碼子。2、已成功構(gòu)建pcDNA3.1（+）-Nras表達(dá)質(zhì)粒。17整理課件五、工作進(jìn)展1、已分別成功突變NRAS基因12位密碼子和61圖1細(xì)胞中PCR擴(kuò)增NRAS的結(jié)果1DL2000marker2,3PCR產(chǎn)物（約570bp）圖2Pcdna3.1-NRAS酶切鑒定的結(jié)果1DL2000marker2DL15000marker3,4Pcdna3.1-NRAS18整理課件圖1細(xì)胞中PCR擴(kuò)增NRAS的結(jié)果圖2Pcdna3.1-NS1基因eIF4GI結(jié)合區(qū)缺失株對(duì)病毒增殖及細(xì)胞因子影響的研究19整理課件NS1基因eIF4GI結(jié)合區(qū)缺失株對(duì)病毒增殖及細(xì)胞因子影響的研究目的研究背景實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)內(nèi)容20整理課件研究目的20整理課件

研究目的通過(guò)對(duì)NS1基因eIF4GI結(jié)合區(qū)不同缺失株生物學(xué)特性的比較，分析NS1蛋白中eIF4GI結(jié)合位點(diǎn)氨基酸對(duì)病毒增殖、復(fù)制的影響，以及對(duì)細(xì)胞因子的抑制作用。21整理課件研究目的通過(guò)對(duì)NS1基因eIF4GI結(jié)合區(qū)不同

NS基因編碼NS1、NS2蛋白。NS1蛋白對(duì)流感病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及裝配成病毒粒子這一系列過(guò)程都有影響。

研究背景22整理課件NS基因編碼NS1、NS2蛋白。NS1蛋白對(duì)流感病毒CPSF,cleavageandpolyadenylationspecificityfactor;eIF4GI,eukaryoticinitiationfactor4GI;NES,nuclearexportsignal;PABII,poly(A)-bindingprotein.

研究背景23整理課件CPSF,cleavageandpolyadenyla

研究背景NS1蛋白可以結(jié)合dsRNA，抑制誘導(dǎo)IFN激活酶PKR的活性而成為IFN的拮抗物。近幾年研究熱點(diǎn)主要是流感病毒NS1基因在病毒復(fù)制及逃離宿主免疫反應(yīng)的重要作用。目前這些研究主要集中在NS1的mRNA結(jié)合區(qū)。24整理課件研究背景NS1蛋白可以結(jié)合dsRNA，抑制誘導(dǎo)I2000年后分離的病毒中大部分毒株在80-84位出現(xiàn)5個(gè)氨基酸的缺失，5個(gè)氨基酸的缺失位置正好處于真核轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子（eIF4GI）結(jié)合區(qū)內(nèi)（第81-113氨基酸處）。eIF4GI結(jié)合區(qū)可以調(diào)節(jié)并優(yōu)先病毒mRNA的翻譯，同時(shí)抑制宿主細(xì)胞mRNA的翻譯，包括干擾素的表達(dá)等，但該區(qū)域在拮抗IFN等細(xì)胞因子產(chǎn)生和逃離宿主免疫反應(yīng)中的具體作用如何還未有詳細(xì)報(bào)道。

研究背景25整理課件2000年后分離的病毒中大部分毒株在80-84位出現(xiàn)

研究背景26整理課件研究背景26整理課件

研究背景27整理課件研究背景27整理課件

研究背景28整理課件研究背景28整理課件NS1基因eIF4GI結(jié)合區(qū)缺失株

實(shí)驗(yàn)方案29整理課件NS1基因eIF4GI結(jié)合區(qū)缺失株實(shí)驗(yàn)方案29整理課件delNS

virus

實(shí)驗(yàn)方案6日齡（IFN未產(chǎn)生）9日齡（IFN開(kāi)始產(chǎn)生）11日齡（IFN高含量）雞胚細(xì)胞血凝試驗(yàn)IFN-γTNF-αIL-6IL-1βIP-10細(xì)胞因子細(xì)胞凋亡30整理課件delNSvirus實(shí)驗(yàn)方案6日齡（IFN未產(chǎn)生）9日一病毒增殖趨勢(shì)的測(cè)定分別在雞胚和MDCK細(xì)胞上做增殖曲線雞胚上：以0.1EID50的病毒量分別接種6，9，11日齡的雞胚，用血凝試驗(yàn)檢測(cè)接種雞胚24h，48h，72h病毒含量。細(xì)胞上：以MOI=0.1，0.01，0.0001的病毒量感染細(xì)胞，用血凝試驗(yàn)每天檢測(cè)感染細(xì)胞上清中病毒含量，共檢測(cè)5天。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容31整理課件一病毒增殖趨勢(shì)的測(cè)定分別在雞胚和MDCK細(xì)胞上做增殖曲線二細(xì)胞因子的測(cè)定以合適MOI的病毒量感染MDCK細(xì)胞，四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，real-timequantitative-PCR檢測(cè)感染后細(xì)胞IFN-γ，TNF-α，IL-6，IL-1β，IP-10細(xì)胞因子mRNA水平

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容32整理課件二細(xì)胞因子的測(cè)定以合適MOI的病毒量感染MDCK細(xì)三細(xì)胞凋亡對(duì)于感染病毒的細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞凋亡程度。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容形態(tài)學(xué)是鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片