大學(xué)職業(yè)規(guī)劃

九十六年度教育部

「生物及醫(yī)學(xué)科技人才培育先導(dǎo)型計(jì)畫」

基因體與蛋白質(zhì)體醫(yī)學(xué)暑期學(xué)分班課程表

課程名稱:進(jìn)階實(shí)驗(yàn)課程B—細(xì)胞科技實(shí)驗(yàn)

學(xué)分?jǐn)?shù):1學(xué)分(實(shí)驗(yàn))負(fù)責(zé)教師:黃昭祥、楊堉麟、葉怡玲

授課時(shí)間:96/08/04,05,11,12教室:尖端生物技術(shù)科技人才培育計(jì)畫實(shí)驗(yàn)室

主題：細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)與分析運(yùn)用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞程式性死亡PARTII九十六年度教育部

「生物及醫(yī)學(xué)科技人才培育先導(dǎo)型計(jì)畫」

基因基因表現(xiàn)產(chǎn)物之分析SEAP:

實(shí)驗(yàn)規(guī)劃基因表現(xiàn)產(chǎn)物之分析SEAP:

實(shí)驗(yàn)規(guī)劃96well(一,二組)123456789101112ABPNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-MycBMP:1ugCDEFPNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-MycBMP:2ugGH96well(一,二組)12345678910111296well(三,四組)123456789101112ABPNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-MycBMP:4ugCDEFPM13CONNF-kBM13CONC-MycM13BMP2NF-kBM13BMP2C-MycBMP:1ugGH96well(三,四組)12345678910111296well(五,六組)123456789101112ABPM13CONNF-kBM13CONC-MycM13BMP2NF-kBM13BMP2C-MycBMP:2ugCDEFPM13CONNF-kBM13CONC-MycM13BMP2NF-kBM13BMP2C-MycBMP:4ugGH96well(五,六組)12345678910111訊息誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素SEAP基因BMP-2基因產(chǎn)物誘導(dǎo)SEAP基因表現(xiàn)（本次實(shí)驗(yàn)）BMP-2基因SignaltransductionBMP2receptorpMyc-SEAPMycelement訊息誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素S訊息誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素SEAP基因BMP-2基因產(chǎn)物誘導(dǎo)SEAP基因表現(xiàn)（本次實(shí)驗(yàn)）BMP-2基因SignaltransductionBMP2receptorpMyc-SEAPMycelement訊息誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素S實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用意探討B(tài)MP-2基因表現(xiàn)是否可以誘導(dǎo)特定轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用意探討B(tài)MP-2基因表現(xiàn)是否可以誘導(dǎo)特定轉(zhuǎn)錄因子表轉(zhuǎn)殖基因表現(xiàn)的分析SEAPDETECTIONSYSTEM轉(zhuǎn)殖基因表現(xiàn)的分析SEAPDETECTIONSYSTEMPPT大學(xué)職業(yè)規(guī)劃PPT大學(xué)職業(yè)規(guī)劃PPT大學(xué)職業(yè)規(guī)劃WHY原理簡(jiǎn)介WHY原理簡(jiǎn)介WHY冷光betterthan螢光？LOWBACKGROUND:HIGHS/NRATIOHIGHSENSITIVITY(duetoabovereasons)EVENBETTERTHANISOTOPE偵測(cè)波長決定偵測(cè)靈敏度靈敏Gamma-rayX-ray冷光螢光可見光WHY冷光betterthan螢光？LOWBAC偵測(cè)波長決定偵測(cè)解析度解析度Gamma-rayX-ray冷光螢光可見光0.1mm1nm0.1nmEMSFMSLMSmm偵測(cè)波長決定偵測(cè)解析度解析度Gamma-rayX-rPathwayProfilingSystemDetectionsystem一.材料

:AssayBuffer,chemiluminescentenhancer,5XDilutionBuffer,25mMCSPD（冷光受質(zhì)）

Positivecontrolplacentalalkalinephosphatase

二.試驗(yàn)前配置的workingsolution:1.1XDilutionBuffer:以

Mini-Qwater將5XDilutionBuffer做

1:5稀釋2.1.25mMCSPDSubstrateworkingsolution:將25mMCSPDchemiluminescentsubstrate與chemiluminescentenhancer做1:19稀釋PathwayProfilingSystemDetec各重要成分介紹各重要成分介紹

三.步驟

:1.將15mlsample加到96-wellplates的每個(gè)well裡2.再加入45ml的1XDilutionBuffer至每個(gè)samplewell中，混合均勻3.將step2

的dilutedsample在65Oc的水浴漕裡，反應(yīng)30分鐘4.反應(yīng)30分鐘後，再將96-wellplate放在冰上2~3分鐘回溫5.再加入60ml的Assaybuffer至每個(gè)samplewell裡，反應(yīng)5分鐘6.再加入60ml的dilutedCSPDSubstrate至每個(gè)samplewell中，反應(yīng)10分鐘7.並在step6之後的30分鐘內(nèi)，以x-ray方式壓片/洗片（定影,顯影）

三.步驟:1.將15mlsample加到96-wePPT大學(xué)職業(yè)規(guī)劃Why

heating65’C考Whyheating65’C考Why

AssaybufferRx5‘考WhyAssaybufferRx5‘考結(jié)果分析結(jié)果分析預(yù)期結(jié)果PNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-Myc（第一組為例）結(jié)論？結(jié)論？結(jié)論？結(jié)論？結(jié)論？預(yù)期結(jié)果PNRKNRKNRKNRK（第一組為例）結(jié)論？結(jié)論？預(yù)期結(jié)果結(jié)論？（第一組為例BMP:

1ug）（第二組為例BMP:

2ug）（第三組為例BMP:

4ug）PNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-Myc預(yù)期結(jié)果結(jié)論？（第一組為例BMP:1ug）（第二組為例使用細(xì)胞NRK:NORMALRATKIDNEY(fibroblastcells)MDCK:MADINDARBYCANINEKIDNEY(tubule)M13:MURINEMESANGIALCELLS使用細(xì)胞NRK:NORMALRATKIDNEY(fiApoptosis組別實(shí)驗(yàn)內(nèi)容規(guī)劃

NRK

、NRK+植物萃取物A

NRK+植物萃取物B、NRK+H2O2

NRK+pCMV-BMP2

M13、M13+BSA

MDCK、MDCK+Mannitol、MDCK+H2O2

M13+H2O2

Apoptosis組別實(shí)驗(yàn)內(nèi)容規(guī)劃NRK、NRK+植物步驟首先將上清液移至15ml離心管。加入1ml的

PBSwash細(xì)胞，勿沖洗避免細(xì)胞剝落。將上清液移至步驟1的離心管。加入1ml的Tyrpsin在37℃反應(yīng)5min。加入3ml的PBS將細(xì)胞洗下並移到步驟1的離心管。加入3ml的將細(xì)胞徹底洗下並移到步驟1的離心管。使用2000rpm離心細(xì)胞5min後，再以同轉(zhuǎn)數(shù)再離心1min。倒去上清液，並可使用200μl的Tip吸乾殘餘的PBS，移入

Flow管。加入100uL染劑,於RT培養(yǎng)30分鐘,持續(xù)震盪加入200μl的Bindingbuffer並充分混合均勻。上機(jī)分析，分析前請(qǐng)?jiān)俅位旌暇鶆虮苊饧?xì)胞沉澱。

ReadFL-1(Annexin)andFL-2(PI)步驟首先將上清液移至15ml離心管。試劑置備與參數(shù)設(shè)定stainingsol’n配製：

32μlannexinV-FITC+800μLbindingbuffer+32μLPropidiumiodine(PI)=600μl

Flowcytometer設(shè)定參數(shù)P1-FSCLinP2-SSCLinP3–FL-1(Annexin-V)LogP4–FL-2(PI)Log試劑置備與參數(shù)設(shè)定stainingsol’n配製：DetectionofROSDetectionofROSIntroduction盡可能避光Introduction盡可能避光H2DCFDAIntracellularEsteraseOxidizedbyROS黃綠螢光DetectbyFlowcytometerROSDETECTIONPRINCIPLEH2DCFDAIntracellularOxidized黃PPT大學(xué)職業(yè)規(guī)劃1.刺激時(shí)間終了後此盤刺激過的細(xì)胞不做任何變動(dòng)並加入約50uM/ml（1mMstocksolution加100μl至各well）的H2DCF-DA

在37℃反應(yīng)30min。2.把上清的medium移到15ml離心管。3.使用2mlPBSwash細(xì)胞然後把PBS移到步驟2的離心管。4.再加入2mlPBS並在室溫反應(yīng)10min。5.將此PBS移到步驟2。6.加入0.5mltrypsin在37℃反應(yīng)

5min。7.然後使用步驟2的離心管內(nèi)的PBS+Medium的混合液沖洗細(xì)胞並移到步驟2。8.以2000rpm離心

5min。9.倒去上清液,再加入2mlPBS並mix細(xì)胞，使細(xì)胞打散。10.再以2000rpm離心5min。11.倒去上清液,然後再加入1mlFlowcytometer專用的PBS並混

合均勻。12.將步驟11移動(dòng)到Flowcytometer專用的試管13.上機(jī)分析上機(jī)分析，分析前請(qǐng)?jiān)俅位旌暇鶆虮苊饧?xì)胞沉澱。實(shí)驗(yàn)步驟

1.刺激時(shí)間終了後此盤刺激過的細(xì)胞不做任何變動(dòng)並加入約5NRKCONCON+DCFHCON+DCFH

植物萃取物A

+

DCFH

第1組實(shí)驗(yàn)組別規(guī)劃

植物萃取物A

+

DCFH

植物萃取物A

+

DCFH

植物萃取物A對(duì)纖維母細(xì)胞氧化壓力的影響NRKCONCON+DCFHCON+DCFH植物萃取物ANRKCONCON+DCFHCON+DCFH第2組

植物萃取物B

+

DCFH

植物萃取物B

+

DCFH

植物萃取物B

+

DCFH

植物萃取物B對(duì)纖維母細(xì)胞氧化壓力的影響NRKCONCON+DCFHCON+DCFH第2組植物萃取NRKCONCON+DCFHCON+DCFHpCMV-BMP2+DCFH第3組BMP-2基因表現(xiàn)對(duì)纖維母細(xì)胞氧化壓力的影響pCMV-BMP2+DCFHpCMV-BMP2+DCFHNRKCONCON+DCFHCON+DCFHpCMV-BMPM13CONCON+DCFHBSA+DCFHH2O2+DCFHBSA+DCFHH2O2第4組(只做上面一排)H2O2與白蛋白對(duì)腎絲球細(xì)胞氧化壓力的影響M13CONCON+DCFHBSA+DCFHH2O2+DCFMDCKCONCON+DCFHMannitol+DCFHCON+D