DNA測(cè)序-化學(xué)降解法-課件

DNA序列測(cè)定DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/261DNA序列測(cè)定DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCTDNA的基本單位－脫氧核苷酸腺嘌呤鳥(niǎo)嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/262脫氧含氮堿基磷酸AGCTDNA的基本單位－脫氧核苷酸腺嘌呤鳥(niǎo)

DNA測(cè)序：測(cè)定未知序列確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定比較研究DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/263DNA測(cè)序：測(cè)定未知序列DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件成熟的DNA測(cè)序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期。●1977年Maxam和Gilbert報(bào)道了通過(guò)化學(xué)降解測(cè)定DNA序列的方法。●同一時(shí)期,Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法●

20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)將DNA測(cè)序帶入自動(dòng)化測(cè)序的時(shí)代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測(cè)序技術(shù)。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/264成熟的DNA測(cè)序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期。DNA測(cè)序化第二代測(cè)序技術(shù)DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/265第二代測(cè)序技術(shù)DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3DNA測(cè)序化學(xué)降解法測(cè)序技術(shù)454SolexaSOLiD上市時(shí)間200520072007價(jià)格（萬(wàn)美元，2007）504559單次反應(yīng)數(shù)據(jù)量0.42050讀長(zhǎng)（bp）40050*250優(yōu)勢(shì)長(zhǎng)讀長(zhǎng)低測(cè)序成本，高性價(jià)比高通量，高準(zhǔn)確度DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/266DNA測(cè)序化學(xué)降解法測(cè)序技術(shù)454SolexaSOLiD上第三代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)在制備測(cè)序文庫(kù)的時(shí)候都需要經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，而這一PCR過(guò)程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測(cè)序的讀長(zhǎng)普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和納米孔為標(biāo)志的第三代測(cè)序技術(shù)。

DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/267第三代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)在制備測(cè)序文庫(kù)的時(shí)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法基本原理：直接或間接特異性識(shí)別4種堿基特定化學(xué)試劑可對(duì)堿基進(jìn)行特異性修飾在修飾堿基處(5‘或3’)打斷磷酸二酯鍵將一個(gè)DNA片段的5'端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一而5'端被標(biāo)記的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA的堿基序列。操作步驟

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/268Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法基本原理：直DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/269DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/269DNA測(cè)序化學(xué)降解法①先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10—200bp

的測(cè)序材料；②用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5′末端上的磷酸；③在5′OH端標(biāo)記32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；④標(biāo)記片段變性為單鏈；⑤用特異的化學(xué)試劑作用于不同的堿基進(jìn)行修飾，然后用哌啶甲酸切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈，緊接著用四組不同的特異反應(yīng)可以使末端標(biāo)記的DNA分子切成不同長(zhǎng)度的片段，產(chǎn)生一組其末端都是該特異堿基的長(zhǎng)度不等的DNA片段；⑥經(jīng)電泳和放射性自顯影后，從4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀，待測(cè)DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2610DNA測(cè)序化學(xué)降解法①先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10—該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)：堿基的特異性修飾；修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移；失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。專門(mén)用來(lái)對(duì)核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2611該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異

肼，又稱聯(lián)氨NH2.NH2

在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。如果加入高濃度的鹽（1.5MNaCl），肼則主要作用于胞嘧啶C使之?dāng)嗔选Ｔ诟邷貜?qiáng)堿作用(90℃,1.2MNaOH)下可使腺嘌呤A位點(diǎn)發(fā)生劇烈的斷裂反應(yīng),但對(duì)胞嘧啶C的反應(yīng)較弱哌啶甲酸(90℃,1mol/L)在修飾位點(diǎn)兩端使DNA的糖-磷酸鏈斷裂

胞嘧啶胸腺嘧啶DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2612肼，又稱聯(lián)氨NH2.NH2哌啶甲酸(90℃,1mol/

硫酸二甲酯[dimethylsulphate，DMS，（CH3O）2SO2]：

一種堿性化學(xué)試劑，可以使DNA鏈上的腺嘌呤A的N2和鳥(niǎo)嘌呤G的N７甲基化，但是鳥(niǎo)嘌呤G的N７甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH環(huán)境中，DMS主要作用于鳥(niǎo)嘌呤G，使之甲基化，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。熱哌啶：使DNA鏈上的嘌呤在酸的作用下發(fā)生糖苷水解，導(dǎo)致DNA鏈在脫嘌呤位點(diǎn)（G和A）發(fā)生斷裂。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2613

硫酸二甲酯[dimethylsulphate，DMSDNA化學(xué)降解反應(yīng)體系反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯鳥(niǎo)嘌呤甲基化六氫吡啶

GG+A甲酸

脫嘌呤作用六氫吡啶

G和AC+T肼嘧啶開(kāi)環(huán)六氫吡啶

C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開(kāi)環(huán)六氫吡啶

C

DMS（硫酸二甲酯）在中性pH環(huán)境，主要作用于G，被六氫吡啶作用而造成該位點(diǎn)上DNA鏈的斷裂。

甲酸具有脫嘌呤作用。DNA鏈在脫嘌呤位點(diǎn)(G和A)發(fā)生斷裂。肼，在堿性條件下，作用于T胸腺嘧啶和C胞嘧啶，在具有六氫吡啶的條件下，導(dǎo)致在這個(gè)核苷酸位置上發(fā)生DNA鏈的斷裂。如果在反應(yīng)體系中加入高濃度的鹽，同胸腺嘧啶的反應(yīng)速率便會(huì)下降，主要作用于C胞嘧啶。A>C肼

90

C,NaOH(1.2M)斷裂反應(yīng)DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2614DNA化學(xué)降解反應(yīng)體系DMS（硫酸二甲酯）在中性pH環(huán)境，DNA測(cè)序化學(xué)降解法

在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔袲NA的機(jī)制是：

G+A反應(yīng)----（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。

G反應(yīng)----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開(kāi)了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥(niǎo)嘌呤與核糖的結(jié)合。

T+C反應(yīng)----肼斷開(kāi)了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。C反應(yīng)----在NaCl存在時(shí)，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2615DNA測(cè)序化學(xué)降解法在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑DNA測(cè)序化學(xué)降解法

在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔袲NA的機(jī)制是：

G+A反應(yīng)----（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。

G反應(yīng)----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開(kāi)了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥(niǎo)嘌呤與核糖的結(jié)合。

T+C反應(yīng)----肼斷開(kāi)了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。C反應(yīng)----在NaCl存在時(shí)，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2616DNA測(cè)序化學(xué)降解法在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2617DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2617哌啶DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2618哌啶DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件5′—GATCACTACTG—3′標(biāo)記5′—*GATCACTACTG—3′G：DMSC：肼（加鹽）G+A：甲酸C+T：肼5′-*GATCACTACTG5′-*GG5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTA5′-*GATCA5′-*GA5′-*G5′-*GATCACTAC5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATC5′-*GAT5′-*GATCACTACT5-*GATCACTACTG-5′-*GATCACTAC5′-*GATCAC5′-*GATC-*GATCACTACTG-DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/26195′—GATCACTACTG—3′標(biāo)記5′—*GAT在化學(xué)修飾反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是隨機(jī)斷裂。在4個(gè)反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長(zhǎng)短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識(shí)別，沒(méi)有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計(jì)。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2620在化學(xué)修飾反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部DNA測(cè)序化學(xué)降解法在化學(xué)修飾反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是隨機(jī)斷裂。在4個(gè)反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長(zhǎng)短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識(shí)別，沒(méi)有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計(jì)。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2621DNA測(cè)序化學(xué)降解法在化學(xué)修飾反應(yīng)過(guò)程中，DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2622DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2622DNA測(cè)序化學(xué)降解法具體的測(cè)定過(guò)程中，首先將3’端或5’端的雙鏈DNA溶解在總體積為50μL的、分別含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/LEDTA、0.05%二甲苯藍(lán)和0.05%溴甲酚藍(lán)的溶液中，使雙鏈DNA變性。然后加到由5%~10%的丙烯酰胺、0.16%~0.33%的雙丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.3的1mmol/LEDTA組成的凝膠板上，進(jìn)行電泳和放射性自顯影等處理，制得一端帶標(biāo)記的單鏈DNA。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2623DNA測(cè)序化學(xué)降解法具體的測(cè)定過(guò)程中，首先將3’端或5’端DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2624DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件20DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2625DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件20DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2626DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件20DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2627DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件20DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2628DNA測(cè)序化學(xué)降解法DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件20化學(xué)法讀序的方法化學(xué)法測(cè)序放射自顯影圖譜的識(shí)讀，比較復(fù)雜一些，這是因?yàn)榛瘜W(xué)裂解反應(yīng)并不完全是堿基特異性的，每組測(cè)序圖譜為4或5條垂直的階梯帶，A>C反應(yīng)可以不做。該片從膠底部一個(gè)個(gè)向頂部讀，G+A和C+T兩列中含有所有相差一個(gè)堿基的DNA片段。如果G+A中出現(xiàn)1條帶就看G列中是否有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無(wú)則為A堿基；同理，C+T中則檢查C列中有無(wú)同樣大小條帶，有即為C，無(wú)則為T(mén)。在做了A>C反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)較深的帶時(shí)，可以幫助確定為A堿基。化學(xué)法必須4或5個(gè)反應(yīng)管統(tǒng)一閱讀，DNA中4個(gè)堿基每個(gè)位置都有1個(gè)相應(yīng)的片段，待測(cè)的DNA全部序列可直接讀出?；瘜W(xué)法測(cè)序采用32P標(biāo)記DNA進(jìn)行，條帶會(huì)較末端法更模糊，更寬，由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為200-300bp以內(nèi)。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2629化學(xué)法讀序的方法化學(xué)法測(cè)序放射自顯影圖譜的識(shí)讀聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長(zhǎng)短分開(kāi),根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列。如果G+A中出現(xiàn)1條帶就看G列中是否有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無(wú)則為A堿基；同理，C+T中則檢查C列中有無(wú)同樣大小條帶，有即為C，無(wú)則為T(mén)。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2630聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長(zhǎng)短分開(kāi),根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)DNA測(cè)序化學(xué)降解法在做了A>C反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)較深的帶時(shí)，可以幫助確定為A堿基。DNA測(cè)序化學(xué)降解法ppt課件2021/3/2631DNA測(cè)序化學(xué)降解法在做了A>C反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)較深的帶時(shí)，可DNA序列測(cè)