熒光顯示細(xì)胞器和細(xì)胞凋亡

關(guān)于熒光顯示細(xì)胞器和細(xì)胞凋亡膜相結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜核被膜線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體溶酶體過氧化物酶體非膜相結(jié)構(gòu)細(xì)胞骨架微管微絲中間纖維核骨架，核纖層細(xì)胞結(jié)構(gòu)染色質(zhì)，染色體，核仁，核糖體第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4人一組細(xì)胞核的熒光顯示P60-62線粒體的熒光標(biāo)記P70內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光標(biāo)記P64-67細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天常用熒光染料的激發(fā)及發(fā)射波長

FluorescentDye

Excitation（激發(fā)頻譜，nm）

Emission（發(fā)射頻譜，nm）

Cy2TM

489

506

GFP(RedShifted)

488

507

YO-PROTM-1

491

509

YOYOTM-1

491

509

Calcein

494

517

FITC

494

518

FluorXTM

494

519

AlexaTM488

490

520

Rhodamine110

496

520

ABI,5-FAM

494

522

OregonGreenTM500

503

522

OregonGreenTM488

496

524

RlboGreenTM

500

525

RhodamineGreenTM

502

527

Rhodamine123

507

529

MagnesiumGreenTM

506

531

CalciumGreenTM

506

533

TO-PROTM-1

514

533

TOTO?-1

514

533

ABI,JOE

520

548第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天FluorescentDye

Excitation（激發(fā)頻譜，nm）

Emission（發(fā)射頻譜，nm）BODIPY?530/550

530

550

Dil

549

565

BODIPY?TMR

542

568

BODIPY?558/568

558

568

BODIPY?564/570

564

570

Cy3TM

550

570

TRITC

547

572

MagnesiumOrangeTM

550

575

Phycoerythrin,R&B

565

575

RhodaminePhalloidin

550

575

CalciumOrangeTM

549

576

PyroninY

555

580

RhodamineB

555

580

RhodamineRedTM

570

590

Cy3.5TM

581

596

ABI,ROX

588

608

CalciumCrimsonTM

590

615第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天FluorescentDye

Excitation（激發(fā)頻譜，nm）

Emission（發(fā)射頻譜，nm）

TexasRed?

595

615

NileRed

549

628

YO-PROTM-3

612

631

YOYOTM-3

612

631

R-Phycocyanin

618

642

C-Phycocyanin

620

648

TO-PROTM-3

642

660

TOTO?-3

642

660

DiDDilC'(5)

644

665

Cy5TM

649

670

Thiadicarbocyanine

651

671

Cy5.5

675

694第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天1.細(xì)胞核的熒光顯示P60-62

吖啶橙（AcridineOrange)

吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA雙鏈間與雙鏈DNA結(jié)合，經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出亮綠色熒光，又可以靜電堆積的方式與單鏈DNA或RNA的磷酸根結(jié)合，藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出橘紅色熒光，從而清晰的顯示DNA,RNA。異染色質(zhì)（核內(nèi)深染）和常染色質(zhì)（核內(nèi)淺染）第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)方法:P621.將生長有培養(yǎng)細(xì)胞的蓋玻片（注意細(xì)胞面向上）置于一次性小培養(yǎng)皿內(nèi)，加入95％乙醇固定15－30分鐘，取出自然干燥；2.加入1％醋酸酸化30秒；3.在蓋玻片標(biāo)本上滴加0.01％吖啶橙染液，染色5－10分鐘；4.去染液，用磷酸緩沖液沖洗1分鐘；5.用1/10氯化鈣分化30秒－3分鐘；6.用PBS漂洗玻片3次，每次數(shù)秒；7.臨時(shí)封片：滴1－2滴PBS于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞核呈綠色（DNA),細(xì)胞質(zhì)呈橙紅色。第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2.線粒體的熒光標(biāo)記P70羅丹明123－－特異性的線粒體熒光染料,是膜電位敏感的陽離子熒光素，活細(xì)胞線粒體具有大量質(zhì)子積累造成的外正內(nèi)負(fù)跨膜電位，吸引染料并將它保持在線粒體中,經(jīng)藍(lán)光激發(fā),呈現(xiàn)黃綠色熒光.可作為線粒體膜電位的靈敏指示.羅丹明123結(jié)構(gòu)式第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天電子傳遞和氧化磷酸化的偶聯(lián)第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)方法:P71取出已培養(yǎng)好細(xì)胞的蓋玻片，用PBS(+)沖洗3次，每次漂洗浸泡2--3分鐘，2.加入羅丹明123標(biāo)記液，37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘，3.吸去標(biāo)記液，PBS液洗3次，每次3--5分鐘，4.臨時(shí)封片：滴1－2滴緩沖液于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞核附近發(fā)綠色熒光的圓形或短桿狀顆粒即為線粒體第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光標(biāo)記P64-671.材料培養(yǎng)細(xì)胞爬片2.試劑儲(chǔ)存液：0.5mg/mLDIO-C6(3)存儲(chǔ)液，4℃避光，標(biāo)記液：2.5ug/mLDIO-C6(3)，

4℃避光。

0.5%戊二醛第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)方法:P67取出已培養(yǎng)好細(xì)胞的蓋玻片，用0.5%戊二醛PBS溶液固定細(xì)胞10分鐘，2.吸去固定液，用PBS液洗3次，每次漂洗時(shí)浸泡

3--5分鐘2.滴加DIO-C6(3)熒光染液，室溫染色1分鐘，3.吸去標(biāo)記液，PBS液洗3次，每次5分鐘，4.臨時(shí)封片：滴1－2滴緩沖液于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4.細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmedcelldeath簡稱PCD），是由基因編程控制的細(xì)胞主動(dòng)參與的自殺過程，是一種生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，與細(xì)胞壞死的死亡機(jī)制是完全不同。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一，在機(jī)體中承擔(dān)著重要的調(diào)控作用。它不僅在維持細(xì)胞群體數(shù)量的穩(wěn)定、胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)的克隆選擇方面，而且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、抗腫瘤藥物的治療等方面均具有十分重要的作用。第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天凋亡(Apoptosis)壞死(Necrosis)（1）定義：一種與遺傳機(jī)制有關(guān)的(即由基因調(diào)控的)主動(dòng)的、自發(fā)死亡的方式，無炎癥反應(yīng)。外在的致?lián)p傷因素作用達(dá)到一定強(qiáng)度，持續(xù)一定時(shí)間后所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡（被動(dòng)），有炎癥反應(yīng)。（2）形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞核：核濃縮、碎裂(染色質(zhì)濃縮→有規(guī)律性、斷裂成核碎片)，有新月形凋亡小體。細(xì)胞器：完整細(xì)胞膜：完好細(xì)胞體積：細(xì)胞濃縮在組織中：常呈單個(gè)細(xì)胞發(fā)生

核溶解(無規(guī)律的染色質(zhì)團(tuán)塊→溶解)無規(guī)律性。崩解尚失去完整性細(xì)胞腫脹常成群細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（3）、生物化學(xué)檢測核DNA有規(guī)律斷裂50～300kb/或180bp左右的片斷凝膠電泳：呈梯形條帶(ladder)DAPI螢光染色，片狀、顆粒狀核熒光。流式細(xì)胞儀檢測：可見亞G1峰(AP峰)

核基因表達(dá)：必須

DNA酶活性：必須蛋白激酶活性：必須細(xì)胞器環(huán)境：Na+/K+泵功能完好

DNA無規(guī)律地?cái)嗔褩l帶不清（smears）無顆?；蚱瑺詈藷晒獬霈F(xiàn)無此峰

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功能喪失第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察熒光顯微鏡觀察法－Hoechst33258染色法1.

材料：CHO細(xì)胞2.器材：細(xì)胞培養(yǎng)所需設(shè)備，熒光顯微鏡。

試劑(1)

細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑：放線菌素D5mg粉劑用1mLDMSO（二甲亞風(fēng)）濃度(5mg/mL)充分溶解，分裝-20℃避光保存，(2)Hoechst33258染液：稱取Hoechst332581mg,用20mL蒸餾水溶解，過濾，4℃避光保存。用時(shí)用蒸餾水10倍稀釋成染色液，pH7.0(3)

固定液：4%多聚甲醛(4)

PBS液第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天放線菌素D是一種抗腫瘤的抗生素類藥