藥物的含量測定方法與驗(yàn)證

關(guān)于藥物的含量測定方法與驗(yàn)證基本要求

一、掌握定量分析方法驗(yàn)證的效能指標(biāo)。二、熟悉定量分析樣品的前處理方法。三、了解定量分析樣品的前處理方法的進(jìn)展及在藥物分析中的應(yīng)用。第2頁,共57頁，2024年2月25日，星期天含量測定：

藥物的含量測定系指運(yùn)用化學(xué)、物理化學(xué)或生物學(xué)的方法測定藥物中主要有效成分的含量。第3頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)容量分析法（一）容量分析法的特點(diǎn)：常用于測定高含量或中含量組分，原料藥含量測定首選比較準(zhǔn)確（相對(duì)誤差＜0.2%）；操作簡單、快速；儀器普通易得；第4頁,共57頁，2024年2月25日，星期天（二）有關(guān)計(jì)算

1.滴定度（T）：每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的質(zhì)量(mg)2.滴定度的計(jì)算

aA（待測物）

+bB（滴定液）

cC+dD

ab

T/M

1·m

T=m×a/b×Mm：滴定液濃度(mol/L)M：被測物分子量第5頁,共57頁，2024年2月25日，星期天3.百分含量的計(jì)算（1）直接滴定法設(shè)至終點(diǎn)時(shí)，消耗滴定液體積為Vml則藥物實(shí)測質(zhì)量為V·T濃度校正因子W：供試品取樣量

第6頁,共57頁，2024年2月25日，星期天（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法）

藥物+A（定、過量）→················剩余的A+B→·······（回滴）······V

空白試驗(yàn)···········································V0第7頁,共57頁，2024年2月25日，星期天光譜

光譜分析法

分光光度法

分類

紫外-可見分光光度法

紅外分光光度法

原子吸收分光光度法

熒光分光光度法

火焰光度法第二節(jié)分光光度法第8頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

二、光譜分析法

（一）紫外-可見分光光度法

吸收光譜范圍：紫外：200～400nm

可見：400～760nm靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml-10-7g/ml1.特點(diǎn)準(zhǔn)確度高，RSD（%）為2%-5%儀器價(jià)格低廉，操作簡單，易普及，應(yīng)用廣范2.朗伯-比耳定律A=ECL

吸收系數(shù)：摩爾吸收系數(shù)ε——研究分子結(jié)構(gòu)百分吸收系數(shù)Ｅ——含量測定第9頁,共57頁，2024年2月25日，星期天3.儀器的校正和檢定

波長的校正：汞燈中的幾根較強(qiáng)的譜線或用儀器自身所帶的氘燈的特定譜線為參照進(jìn)行校正吸收度準(zhǔn)確性的檢定：重鉻酸鉀的硫酸溶液，規(guī)定波長處測定Ｅ，應(yīng)符合規(guī)定雜散光的檢查：一定濃度的碘化鈉和亞硝酸鈉溶液，規(guī)定波長處測定透光率，應(yīng)符合規(guī)定第10頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

4.對(duì)溶劑的要求:含雜原子的有機(jī)溶劑通常具有很強(qiáng)的末端吸收它們的使用范圍均不能小于截止使用波長石英吸收池、空氣為空白

λ(nm)溶劑+吸收池A220～240≤0.40241～250≤0.20251～300≤0.10300以上≤0.05第11頁,共57頁，2024年2月25日，星期天5.測定方法

要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7

1）對(duì)照品比較法：A供／A對(duì)＝C供／C對(duì)原料藥：制劑：第12頁,共57頁，2024年2月25日，星期天2）吸收系數(shù)法：注意：應(yīng)>100應(yīng)注意儀器的校正和檢定：作為計(jì)算濃度的因數(shù)進(jìn)行定量的方法，不是任何情況下都適用的，特別時(shí)單色光不純的情況下，A會(huì)隨儀器不同而變化，誤差較大但若認(rèn)定一臺(tái)儀器，固定其工作狀態(tài)和測定條件，則C和A間的關(guān)系在多數(shù)情況下仍符合Lambert－Beer定律

第13頁,共57頁，2024年2月25日，星期天3）計(jì)算分光光度法：方法有多種，具體按每種藥物規(guī)定的方法進(jìn)行。如：VA的三點(diǎn)校正法4）比色法

加入顯色劑后，按照對(duì)照品比較法測定影響顯色因素很多，故需注意平行操作空白溶劑：溶劑+顯色劑，同法處理第14頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

（二）熒光分析法

靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml～

10-12g/ml

在低濃度進(jìn)行測定，防止自熄滅作用1.特點(diǎn)用基準(zhǔn)溶液代替對(duì)照液校正儀器靈敏度制備熒光衍生物，可提高靈敏度和選擇性

干擾因素多，需做空白實(shí)驗(yàn)樣品用量少，操作簡單，應(yīng)用范圍較廣

第15頁,共57頁，2024年2月25日，星期天2.含量測定

原理：當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時(shí)，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度R與該物質(zhì)濃度C成正比

方法：對(duì)照品比較法計(jì)算：第16頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)色譜法

根據(jù)混合物中各組分的色譜行為差異，先行分離后再在線或離線對(duì)各組分逐一進(jìn)行分析的方法，是分離分析混合物的最有力手段。

按分離原理：吸附；分配；離子交換；空間排阻分類

按分離方法：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC

特點(diǎn)：高靈敏度、高效能、高速度、應(yīng)用廣泛第17頁,共57頁，2024年2月25日，星期天（一）HPLC法

1.對(duì)儀器一般要求

固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測器類型不得任意改變其他均可適當(dāng)改變色譜圖20分鐘內(nèi)記錄完畢

2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)2分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);應(yīng)大于1.5重復(fù)性：對(duì)照液連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD≤2.0％拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.95～1.05

第18頁,共57頁，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相真空脫氣機(jī)四元泵自動(dòng)進(jìn)樣器柱溫箱紫外檢測器蒸發(fā)光散射檢測器第19頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜檢測器第20頁,共57頁，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相：對(duì)于以C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，常用甲醇-水，間或加以乙腈、緩沖液等為流動(dòng)相，有機(jī)溶劑比例通常不低于5％第21頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四元泵第22頁,共57頁，2024年2月25日，星期天自動(dòng)進(jìn)樣器第23頁,共57頁，2024年2月25日，星期天色譜柱填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠第24頁,共57頁，2024年2月25日，星期天檢測器第25頁,共57頁，2024年2月25日，星期天測定方法1)內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量峰面積含量對(duì)照液（R）：ARCR

內(nèi)標(biāo)液（S）：ASCS供試液（X）：AXCXf=————AS/CSAR/CRf=————A’S/C’SAx/CxCx=f·————

AxA’S/C’S第26頁,共57頁，2024年2月25日，星期天2)外標(biāo)法測定供試品中主成分含量對(duì)照液（R）：ARCR

供試液（X）：AXCX要求：進(jìn)樣量準(zhǔn)確、操作條件穩(wěn)定CXCRAXAR——＝——CX＝————CR·AXAR第27頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

（二）GC法1.對(duì)GC儀器一般要求

載氣：氮?dú)馍V柱：填充柱或毛細(xì)管柱填充柱：內(nèi)徑2～4mm，長1～10m，內(nèi)裝吸附劑高分子多孔小球或涂漬固定液的載體毛細(xì)管柱：內(nèi)徑0.2～0.5mm，長10～100m，一般為空心柱，內(nèi)壁或載體經(jīng)涂漬或交聯(lián)固定液檢測器：氫火焰離子化檢測器色譜圖：30分鐘內(nèi)記錄完畢

2.色譜適用性實(shí)驗(yàn)：同HPLC

3.測定法：同HPLC第28頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

第四節(jié)藥品分析方法驗(yàn)證

目的：證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測要求。

起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝變更制劑組分改變?cè)治龇椒ㄐ抻嗱?yàn)證內(nèi)容：準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性均需對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證第29頁,共57頁，2024年2月25日，星期天一、準(zhǔn)確度（accuracy）：測量值與真實(shí)值接近的程度表示:回收率測定方法：回收試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)第30頁,共57頁，2024年2月25日，星期天含量測定方法的準(zhǔn)確度

1.原料藥：可用已知純度對(duì)照品或供試品進(jìn)行測定；或與已知準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較

2.制劑：考察其他組分和輔料對(duì)回收率的影響

①用含已知量被測物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進(jìn)行測定，回收率計(jì)算同原料藥②向制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定

③與已知準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較具體做法：

測定高、中、低三個(gè)濃度，n=3,共9個(gè)數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)回收率；用UV和HPLC法時(shí)，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%第31頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、精密度（precision）：定義:

同一樣品多次測量值之間相互接近的程度表示：偏差，標(biāo)準(zhǔn)偏差,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

1.偏差(deviation,d)

d=測得值-平均值=Xi-X2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation,RSD)

RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=S/X×100%

第32頁,共57頁，2024年2月25日，星期天重復(fù)性:

同一實(shí)驗(yàn)室,同一人多次測定的精密度中間精密度:

同一實(shí)驗(yàn)室，不同人，不同儀器測定的精密度重現(xiàn)性:不同實(shí)驗(yàn)室，不同人測定的精密度數(shù)據(jù)要求均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和可信限第33頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、專屬性（specificity）:指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性（鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性）

1.鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)第34頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

2.含量測定和雜質(zhì)測定

色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。

圖中注明各組分位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對(duì)結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗(yàn)證方法和藥典方法進(jìn)行對(duì)照；也可用對(duì)試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。第35頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

四、檢測限（limitofdetection，

LOD)

是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。1.目視法用含已知濃度被測物的試樣進(jìn)行分析，目視確定能被可靠地檢測出的被測物的最低濃度或量，常用于顯色鑒別法，TLC2.當(dāng)用GC和HPLC法時(shí)，一般以S/N＝2或3時(shí)的相應(yīng)濃度來確定檢測限。第36頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

五、定量限（1imitofquantitation，

LOQ)

是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測定時(shí)，要求LOQ。常用信噪比法確定定量限。一般以S/N=10時(shí)相應(yīng)的濃度進(jìn)行測定。第37頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

六、線性（linearity）

是指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度或量直接呈正比關(guān)系的程度?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)（r）越接近1，表明線性越好可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列（至少5份）供試液進(jìn)行測定，以響應(yīng)值對(duì)濃度作圖，建立回歸方程，求出r如UV：制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5A=0.3-0.7建立回歸方程C=aA+br＞0.9999第38頁,共57頁，2024年2月25日，星期天CA500.22750.351000.451250.581500.69AC線性的偏離………﹍﹍﹍第39頁,共57頁，2024年2月25日，星期天七、范圍

（range）

是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

如原料藥和制劑含量測定：應(yīng)為測試濃度的80%～120%制劑含量均勻度檢查：應(yīng)為測試濃度的70%-～130%。溶出度或釋放度中的溶出量測定：應(yīng)為限度的±20%。第40頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

八、耐用性（robustness）

是指在測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度。典型的變動(dòng)因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。HPLC變動(dòng)因素有：流動(dòng)相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。GC變動(dòng)因素有：色譜柱，固定相，擔(dān)體、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。第41頁,共57頁，2024年2月25日，星期天檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證內(nèi)容：項(xiàng)目內(nèi)容鑒別雜質(zhì)測定含量測定及溶出量測定定量限度準(zhǔn)確度＋＋精密度－＋重復(fù)性＋＋中間精密度＋①＋①專屬性②＋＋＋＋檢測限－③＋－定量限＋－線性＋＋范圍＋＋耐用性＋＋＋①已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需驗(yàn)證中間精密度②如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補(bǔ)充③視具體情況予以驗(yàn)證第42頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

第五節(jié)定量分析樣品的前處理方法一、概述

1.結(jié)構(gòu)特征與分析方法之間的關(guān)系①含鹵素有機(jī)藥物R-X（F，Cl,Br,I）鹵素與芳環(huán)相連Ar-X結(jié)合牢固

鹵素與脂肪鏈相連R-X結(jié)合較不牢固②含金屬有機(jī)藥物

含金屬有機(jī)藥物R-O-Me，有機(jī)酸或酚的金屬鹽/配位化合物；結(jié)合不牢固，可直接測定

有機(jī)金屬藥物R-Me

，結(jié)合牢固，適當(dāng)處理后測定

第43頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法2.藥物分析中常用的分析方法經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法第44頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一）直接測定法

例如：富馬酸亞鐵的含量測定

終點(diǎn)：

鄰二氮菲(+Fe3+)溶于熱稀礦酸指示劑:鄰二氮菲(+Fe2+)紅色淡藍(lán)色Fe3+Fe2+Ce4+第45頁,共57頁，2024年2月25日，星期天（二）經(jīng)水解后測定法

1.堿水解后測定法

適用于X與脂肪鏈相連的鹵代烷烴例如：三氯叔丁醇的含量測定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl↓+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN↓+NH4NO3

2.酸水解后測定法

例如：硬脂酸鎂的含量測定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

△三氯叔丁醇第46頁,共57頁，2024年2月25日，星期天（三）經(jīng)還原分解后測定法

適用于Ar-I的藥物

例如：泛影酸的含量測定指示劑：曙紅鈉終點(diǎn)：黃→紅第47頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法

金屬原子、鹵素等與C結(jié)合牢固者，必須有機(jī)破壞

常用的有機(jī)破壞的方法有濕法破壞干法破壞第48頁,共57頁，2024年2月25日，星期天（一）干法破壞

適用于含鹵素、S、P等有機(jī)藥物分析的前處理，也用于某些藥物中硒及砷鹽的檢查。

1.高溫?zé)胱品訜o水Na2CO3、硝酸鎂、氫氧化鈣或ZnO以助灰化2.氧瓶燃燒法第49頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

1）儀器裝置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬質(zhì)玻璃錐形瓶2）稱樣固體樣；液體樣要求

3）燃燒分解操作法