細(xì)胞培養(yǎng)基本方法從體內(nèi)到體外

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)基本方法從體內(nèi)到體外體外培養(yǎng)（invitroculture）的概念將活體結(jié)構(gòu)成分取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長(zhǎng)和發(fā)育的方法。細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）

組織培養(yǎng)（tissueculture）器官培養(yǎng)（organculture）

第2頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用在組織學(xué)與胚胎學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用在腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用在微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用在免疫學(xué)方面的應(yīng)用在藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用第3頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境方便施加實(shí)驗(yàn)因素容易觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果便于獲得均一細(xì)胞群能夠進(jìn)行大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)第4頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長(zhǎng)條件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過(guò)程三、體外培養(yǎng)物的生長(zhǎng)生物學(xué)四、細(xì)胞分離與純化五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆六、培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法第5頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長(zhǎng)條件體外（invitro）培養(yǎng)技術(shù)就其實(shí)質(zhì)而言，就是模擬體內(nèi)（invivo）的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使活體的結(jié)構(gòu)成分在體外環(huán)境中生存和生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能。第6頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長(zhǎng)條件（一）體內(nèi)細(xì)胞生存的營(yíng)養(yǎng)條件（二）體內(nèi)細(xì)胞生存的其它條件（三）體外生長(zhǎng)大環(huán)境（四）培養(yǎng)用液（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件（六）清洗和消毒第7頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水（water）２、無(wú)機(jī)鹽（inorganicsalt）３、葡萄糖（glucose）４、維生素（vitamin）５、氨基酸（aminoacid）（一）體內(nèi)細(xì)胞生存的營(yíng)養(yǎng)條件第8頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、溫度（temperature）２、氧和酸堿度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、體液滲透壓（osmoticpressureofhumor）４、細(xì)胞之間的相互聯(lián)系（二）體內(nèi)細(xì)胞生存的其它條件第9頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天溫度對(duì)細(xì)胞生存的影響高熱(hyperthermy)對(duì)細(xì)胞生存的影響：高熱導(dǎo)致酶的變性而失活破壞細(xì)胞膜的類脂質(zhì)細(xì)胞核分裂異常破壞紡錘體細(xì)胞漿外層的鈣釋放代謝停止細(xì)胞膜滲透性變化多極分裂出現(xiàn)停止在中期凝固酶使細(xì)胞凝固第10頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天低溫(hypothermy)大多數(shù)細(xì)胞在接近冰點(diǎn)的溫度下仍能存活，當(dāng)溫度達(dá)到冰點(diǎn)時(shí)細(xì)胞活動(dòng)就要相對(duì)停止。溫度下降到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞外的水要發(fā)生結(jié)冰，因而使細(xì)胞周圍的溶液濃縮。結(jié)果，水分從細(xì)胞擴(kuò)散到周圍的溶液中，使細(xì)胞中的溶質(zhì)濃度升高。細(xì)胞中的溶質(zhì)濃度升高對(duì)細(xì)胞是有害的。第11頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天慢速冷凍：當(dāng)細(xì)胞慢慢冷凍至-40℃時(shí)，細(xì)胞外的冰晶會(huì)通過(guò)細(xì)胞的孔隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起冰晶?？焖倮鋬觯菏辜?xì)胞內(nèi)外都形成小的冰晶，不僅使細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度增高到有害的程度，而且細(xì)胞器也會(huì)遭到細(xì)胞內(nèi)冰晶的破壞。所以：在冷凍狀態(tài)下，要減少細(xì)胞的損傷，應(yīng)逐漸降溫，而不宜迅速降溫。低溫(hypothermy)第12頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、溫度（temperature）２、氧和酸堿度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、體液滲透壓（osmoticpressureofhumor）４、細(xì)胞之間的相互聯(lián)系（二）體內(nèi)細(xì)胞生存的其它條件第13頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、氧和酸堿度（oxygen

andpowerofhydrogen）氧酸堿度酸度和堿度的度量采用pH表示，pH即氫離子濃度的負(fù)對(duì)數(shù)值。各種組織細(xì)胞的正常功能及一切生物化學(xué)反應(yīng)，都是在適當(dāng)?shù)暮头€(wěn)定的氫離子濃度下進(jìn)行的。大多數(shù)有機(jī)體的細(xì)胞所耐受的pH范圍為6.0~8.0。人類血液的pH值一般維持在7.36~7.44。是細(xì)胞生存必不可少的條件之一。盡管一些細(xì)胞如骨骼肌細(xì)胞、紅細(xì)胞可通過(guò)糖酵解而獲得能量，但大多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。第14頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、溫度（temperature）２、氧和酸堿度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、體液滲透壓（osmoticpressureofhumor）４、細(xì)胞之間的相互聯(lián)系（二）體內(nèi)細(xì)胞生存的其它條件第15頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天３、體液滲透壓（osmoticpressureofhumor）體液滲透壓主要來(lái)自體液中不能自由透過(guò)細(xì)胞膜的顆粒。血漿晶體滲透壓：由Na+、K+、Cl－、HCO3

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等構(gòu)成；血漿膠體滲透壓：由血漿蛋白質(zhì)等構(gòu)成；正常血漿滲透壓范圍為：280~310mOsm/kg主要由晶體滲透壓組成。等滲溶液(isosmoticsolution)：在正常血漿滲透壓范圍內(nèi)的溶液；高滲溶液(hyperosmoticsolution)：高于310mOsm/kg的溶液；低滲溶液(hyposmoticsolution;)：低于280mOsm/kg的溶液。第16頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、溫度（temperature）２、氧和酸堿度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、體液滲透壓（osmoticpressureofhumor）４、細(xì)胞之間的相互聯(lián)系（二）體內(nèi)細(xì)胞生存的其它條件第17頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天４、細(xì)胞之間的相互聯(lián)系

細(xì)胞間相互聯(lián)系的基礎(chǔ)是胞間通訊。胞間通訊有三種類型：直接接觸型：特點(diǎn)是通過(guò)胞膜表面分子的結(jié)合直接聯(lián)系；直接聯(lián)系型：通過(guò)相鄰的縫隙連接，直接完成信息傳遞；間接聯(lián)系型：是細(xì)胞間通訊的最主要的途徑。通過(guò)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、局部化學(xué)介導(dǎo)因子等化學(xué)信號(hào)的傳播。第18頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞增生的接觸性抑制細(xì)胞增生接觸性抑制是指當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增多時(shí)，細(xì)胞相互接觸而導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止。或者細(xì)胞增殖到一定密度后，細(xì)胞增殖停止。這些現(xiàn)象就是細(xì)胞之間相互溝通信息的表現(xiàn)。第19頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室２、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和器具（三）體外生長(zhǎng)大環(huán)境第20頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室由于組織培養(yǎng)是無(wú)菌操作，要求工作環(huán)境和條件必須保證無(wú)微生物污染和不受其他有害因素的影響。組織培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)原則是防止微生物的污染和有害因素的影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，位置遠(yuǎn)離產(chǎn)生發(fā)生煙塵、污物的工廠區(qū)；環(huán)境應(yīng)是較干燥、無(wú)煙塵和空氣清新區(qū)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)研究任務(wù)、目的和規(guī)模（小組、研究室或更大），以及經(jīng)費(fèi)等條件而定?？捎袃煞N考慮，從空間要求，最小不應(yīng)小于50m2。如接近50m2上下，以一大一小為好。第21頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備室培養(yǎng)室緩沖室其它實(shí)驗(yàn)室第22頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)臺(tái)實(shí)驗(yàn)儀器臺(tái)水池冰箱衣柜載物臺(tái)離心機(jī)櫥柜載物臺(tái)顯微鏡凈化臺(tái)培養(yǎng)箱冰箱遞物小窗試劑柜準(zhǔn)備室培養(yǎng)室緩沖室專用培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖第23頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室２、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和器具（三）體外生長(zhǎng)大環(huán)境第24頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和器具（１）大型設(shè)備和儀器（２）培養(yǎng)器具超凈工作臺(tái)(supercleanbench)培養(yǎng)箱(incubator)倒置顯微鏡(invertedmicroscope)冰箱(refrigerator)冷凍保存(cryopreservation)裝置細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀離心機(jī)(centrifugalmachine)PH計(jì)天平(equi-armbalance)水純化(waterpurification)裝置高壓蒸汽消毒(vaporsterilization)裝置電熱干燥箱(dryingoven)第25頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天第26頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天美國(guó)SHELLABCO2培養(yǎng)箱第27頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天第28頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天第29頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（１）大型設(shè)備和儀器（２）培養(yǎng)器具過(guò)濾除菌(filtrationsterilization)裝置手術(shù)器械(surgicalinstruments)培養(yǎng)器皿(wareforculture)移液器(transferpettor)特殊用具雜用品２、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和器具第30頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天真空式過(guò)濾器第31頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天正壓式不銹鋼濾器抽濾式玻璃簡(jiǎn)易型濾器第32頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天針頭式濾器第33頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（１）大型設(shè)備和儀器（２）培養(yǎng)器具過(guò)濾除菌裝置手術(shù)器械培養(yǎng)器皿移液器特殊用具雜用品２、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和器具第34頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天第35頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天第36頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞過(guò)濾器細(xì)胞凍存管微量移液槍吸頭第37頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)２、培養(yǎng)液(culturesolution)３、其它常用液進(jìn)行體外培養(yǎng)離不開適應(yīng)細(xì)胞在體外生存和生長(zhǎng)的各種溶液，此即培養(yǎng)用液。培養(yǎng)用液主要包括培養(yǎng)液、緩沖液、平衡鹽溶液、血清以及消化液、pH調(diào)整液和抗生素液等其它常用液。（四）培養(yǎng)用液第38頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液水與緩沖液生理鹽水與平衡鹽溶液培養(yǎng)用水緩沖溶液生理鹽水平衡鹽溶液２、培養(yǎng)液３、其它常用液（四）培養(yǎng)用液第39頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液水是培養(yǎng)用液最主要的溶劑。培養(yǎng)用液中的其它成分只有溶解于水中才有利于細(xì)胞吸收攝取。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水（distilledwater，DW），可能會(huì)含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。二次蒸餾水或外購(gòu)的純水只能用于清洗。（１）水與緩沖液（buffersolution）培養(yǎng)用水：（四）培養(yǎng)用液第40頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天蒸餾水的貯存也很重要，蒸餾水應(yīng)貯存于密封的清洗干凈的玻璃瓶?jī)?nèi)，最好用龍頭瓶貯存，用時(shí)由瓶下端的玻璃龍頭放水。盡量少開啟瓶口或從瓶口倒水，以防周圍不潔的環(huán)境和空氣污染水。制備的水存放時(shí)間不宜太長(zhǎng)，一般不超過(guò)2周，最好現(xiàn)制現(xiàn)用。若將所制備的蒸餾水經(jīng)高壓蒸汽消毒，可密封存放較長(zhǎng)時(shí)間。（四）培養(yǎng)用液１、水與平衡鹽溶液（１）水與緩沖液（buffersolution）培養(yǎng)用水：第41頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天由緩沖劑配制成的溶液，在加入一定量的酸或堿時(shí)其氫離子濃度改變甚微或幾乎不變，此種溶液稱為緩沖（溶）液(buffersolution)。緩沖劑的組成，多為弱酸及這種弱酸與強(qiáng)堿所組成的鹽，或弱堿及這種弱堿與強(qiáng)酸所組成的鹽。如碳酸氫鈉／碳酸（NaHCO3／H2CO3

）、磷酸二氫鈉／磷酸氫二鈉（NaH2P04／Na2HP04），調(diào)節(jié)二者的比例便可以配成各種緩沖液。（四）培養(yǎng)用液１、水與平衡鹽溶液（１）水與緩沖液（buffersolution）培養(yǎng)用水：第42頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液（２）生理鹽水與平衡鹽溶液

（normalsodium，NSandbalancedsaltsolution;BSS）生理鹽水:生理鹽水是培養(yǎng)用液中的一種重要類型和培養(yǎng)基的主要成分，在體外培養(yǎng)中應(yīng)用非常廣泛。它可以供給細(xì)胞水分和各種離子，維持一定的滲透壓。同時(shí)，它也是一種良好的溶媒，用以溶解培養(yǎng)用的試劑或藥物等。（四）培養(yǎng)用液第43頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天平衡鹽溶液:平衡鹽溶液（簡(jiǎn)稱鹽溶液）集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)特點(diǎn)于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度、同時(shí)供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分的作用。（四）培養(yǎng)用液１、水與平衡鹽溶液（２）生理鹽水與平衡鹽溶液

（normalsodium，NSandbalancedsaltsolution;BSS）第44頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天平衡鹽溶液:幾種常用的平衡鹽溶液配方(g/L)（四）培養(yǎng)用液１、水與平衡鹽溶液（２）生理鹽水與平衡鹽溶液

（normalsodium，NSandbalancedsaltsolution;BSS）第45頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基血清胚胎浸出液水解乳蛋白合成培養(yǎng)基的種類合成培養(yǎng)基的主要成分合成培養(yǎng)液的配制２、培養(yǎng)液３、其它常用液無(wú)血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)液生長(zhǎng)附加成分（四）培養(yǎng)用液第46頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液(culturesolution)天然培養(yǎng)基(naturalmedium)：血清（serum）：血清（serum）是體外培養(yǎng)中用得最多最廣的天然培養(yǎng)基，絕大部分動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)都要使用血清。血清在動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中起著多方面十分重要的作用：①能提供細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和增生所必需的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子；②能補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒(méi)有或量不足的營(yíng)養(yǎng)成分；③含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長(zhǎng)基質(zhì)成分；（四）培養(yǎng)用液第47頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液天然培養(yǎng)基：血清（serum）：④提供載體蛋白，可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。載體蛋白還可使被結(jié)合的物質(zhì)穩(wěn)定或改變性質(zhì)；⑤在一些情況下，血清有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用；⑥給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)；⑦提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受死細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。（四）培養(yǎng)用液第48頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液天然培養(yǎng)基：血清（serum）：使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，也有難以解決的問(wèn)題：①血清中也存在不少有害于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)。例如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長(zhǎng)抑制因子等；②血清的成分不明確，影響對(duì)結(jié)果的分析；③不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。（四）培養(yǎng)用液第49頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天胚胎浸出液：（略）２、培養(yǎng)液天然培養(yǎng)基：水解乳蛋白：（略）（四）培養(yǎng)用液第50頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基血清胚胎浸出液水解乳蛋白合成培養(yǎng)基的種類合成培養(yǎng)基的主要成分合成培養(yǎng)液的配制２、培養(yǎng)液３、其它常用液無(wú)血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)液生長(zhǎng)附加成分（四）培養(yǎng)用液第51頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液合成培養(yǎng)基(deffinedmedium)：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的類型選擇適合其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是非常重要的。培養(yǎng)基的選擇有一定的原則性，也有一定的靈活性。對(duì)于已建成的細(xì)胞系常選用建系過(guò)程中最初使用的培養(yǎng)基，這是選擇培養(yǎng)基時(shí)必須考慮的原則。對(duì)于開展新的培養(yǎng)工作，尤其是建立新的細(xì)胞系/株，則可參考有關(guān)文獻(xiàn)，選擇和嘗試使用幾種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和比較，摸索各種培養(yǎng)條件。一旦成功，即可按同樣的培養(yǎng)基、血清和培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)。（四）培養(yǎng)用液第52頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液合成培養(yǎng)基：1．合成培養(yǎng)基的種類：（略）2．合成培養(yǎng)基的主要成分：（略）3．合成培養(yǎng)液的配制：現(xiàn)在有各種各樣的商品化的培養(yǎng)基可供選用：液體培養(yǎng)基（liquidmedium），購(gòu)回后直接或稀釋后即可使用。粉制培養(yǎng)基（powderedmedium），按照說(shuō)明書，簡(jiǎn)單配制后即可使用，十分便利快捷。（四）培養(yǎng)用液第53頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液合成培養(yǎng)基：3．合成培養(yǎng)液的配制：一般的配制過(guò)程是：1)取清洗干凈的大燒杯1個(gè)，加入新鮮制備的三蒸水，加熱至15～30℃。2)加1小袋培養(yǎng)基干粉入水中，并用少量三蒸水涮洗裝粉劑培養(yǎng)基的袋，涮洗的水倒入大燒杯中，攪拌使粉劑溶解。3)按照說(shuō)明書，加入所需量的NaHCO3以及其它可能需添加的成分。4)加水至最終量。5)用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH值，必要時(shí)用1mol/LHCl或1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值，一般調(diào)至pH7.0～7.2,因過(guò)濾除菌后，pH值會(huì)升高約0.20。6)用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌。7)分裝，封瓶口。標(biāo)記培養(yǎng)液名稱和配制時(shí)間，置4℃冰箱中貯存。（四）培養(yǎng)用液第54頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基血清胚胎浸出液水解乳蛋白合成培養(yǎng)基的種類合成培養(yǎng)基的主要成分合成培養(yǎng)液的配制２、培養(yǎng)液３、其它常用液無(wú)血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)液生長(zhǎng)附加成分（四）培養(yǎng)用液第55頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液無(wú)血清培養(yǎng)基(serum-freemedium，SFM)無(wú)血清培養(yǎng)基（serumfreemedium，SFM）有時(shí)亦稱為化學(xué)限定性培養(yǎng)基或化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基（chemicallydefinedmedium）。無(wú)血清培養(yǎng)基完全采用人工合成的化合物，是成分確定的培養(yǎng)液。在理論研究中應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)可以排除含血清培養(yǎng)時(shí)血清中許多未知因素的干擾，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。無(wú)血清培養(yǎng)基也有不足之處，一是成本較高；二是無(wú)血清培養(yǎng)基的針對(duì)性很強(qiáng)，一種無(wú)血清培養(yǎng)基僅適用于某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。（四）培養(yǎng)用液第56頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、培養(yǎng)液無(wú)血清培養(yǎng)基（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)液不少合成培養(yǎng)液都可以作為無(wú)血清培養(yǎng)液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basalmedium）。最常用的是HamF12和DMEM混合培養(yǎng)液。兩者以1：1(V:V）混合，再補(bǔ)加6～15mlHEPES與1.2g/LNaHCO3即可作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液。（2）生長(zhǎng)附加成分補(bǔ)加何種營(yíng)養(yǎng)成分主要由各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的種類而設(shè)定，沒(méi)有完全統(tǒng)一的配方。（四）培養(yǎng)用液第57頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、水與平衡鹽溶液２、培養(yǎng)液消化液消化酶抑制劑pH調(diào)整液抗生素液谷氨酰胺液胰蛋白酶溶液EDTA溶液膠原酶溶液３、其它常用液NaHCO3溶液HEPES溶液（四）培養(yǎng)用液第58頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天３、其它常用液在動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)中，除以上介紹的兩大類重要培養(yǎng)用液外，還有一些其它必不可少的常用液。主要包括分離細(xì)胞的消化液，防止微生物污染的抗生素液，調(diào)整培養(yǎng)液酸堿度的pH調(diào)整液。此外，還有用于進(jìn)行培養(yǎng)物組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察的各種染液。（四）培養(yǎng)用液第59頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天３、其它常用液在原代細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞傳代時(shí)，都要使用消化液，最常用的消化液是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）兩種溶液，其次是一些特殊的組織細(xì)胞培養(yǎng)用的各型膠原酶。在原代細(xì)胞培養(yǎng)中，使用消化液從組織塊中分離（散）出單個(gè)的細(xì)胞；在進(jìn)行細(xì)胞傳代時(shí)，消化液使細(xì)胞脫離生長(zhǎng)表面并離散成單個(gè)細(xì)胞。（四）培養(yǎng)用液（1）消化液第60頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天３、其它常用液（1）消化液1)胰蛋白酶溶液(trypsinsolution)：胰蛋白酶的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解而使細(xì)胞離散。不同的組織或細(xì)胞系對(duì)胰蛋白酶的作用反應(yīng)不一樣，胰蛋白酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)濃度大、溫度高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的分離能力越大。胰蛋白酶溶液在pH8.0,溫度為37℃時(shí)，作用能力最強(qiáng)。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可以降低胰蛋白酶的活性，所以配制胰蛋白酶溶掖應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS（Ca2+-Mg2+

freeBSS），如D-Hanks液。（四）培養(yǎng)用液第61頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2)EDTA溶液：EDTA是一種化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versene液，對(duì)細(xì)胞有一定的解離作用，且毒性少、價(jià)格便宜，使用方便。常與胰蛋白酶溶液按一定比例混合使用，亦可單獨(dú)使用，這主要根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種類進(jìn)行選擇。3）膠原酶溶液（collagenasesolution）：有膠原酶I、II、III、IV型以及肝細(xì)胞專用膠原酶五種。（四）培養(yǎng)用液３、其它常用液（1）消化液第62頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）消化酶抑制劑（enzymeinhibitor）３、其它常用液貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞傳代時(shí)須使用消化酶使細(xì)胞脫離生長(zhǎng)表面。在含血清培養(yǎng)時(shí)，血清中的某些成分可中止消化酶對(duì)細(xì)胞的作用。在無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)，則必須使用消化酶抑制劑，以保護(hù)細(xì)胞免受殘留的消化酶的損害。目前常用的酶抑制劑是大豆胰酶抑制劑。（四）培養(yǎng)用液第63頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天３、其它常用液（3）pH調(diào)整液

1)NaHCO3溶液：為了使培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長(zhǎng)貯存時(shí)間，一般不預(yù)先在培養(yǎng)液中或平衡鹽溶液中直接加入NaHCO3，而是單獨(dú)配制，消毒除菌后，在使用前加入。

2)HEPES溶液：HEPES的化學(xué)名全稱為：羥乙基哌嗪乙硫磺酸。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍，尤其是在開瓶通氣培養(yǎng)或觀察時(shí)能維持正常pH。（四）培養(yǎng)用液第64頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天３、其它常用液（4）抗生素液為了預(yù)防因無(wú)菌操作不嚴(yán)而發(fā)生污染，培養(yǎng)液內(nèi)一般需加入適量的抗生素。用于體外培養(yǎng)的抗生素以青霉素應(yīng)用最普遍。通常在培養(yǎng)液中的終濃度為20～100ＩU/ml。青霉素可以和鏈霉素（使用濃度為50μg/ml)聯(lián)合應(yīng)用抑制耐青霉素的菌株。（5）谷氨酰胺溶液（略）（四）培養(yǎng)用液第65頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)課時(shí)間：從第14周開始實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn)：104館三樓東邊注意事項(xiàng)：1.網(wǎng)上沒(méi)有名字的同學(xué)請(qǐng)不要填報(bào)實(shí)驗(yàn)課名單。2.現(xiàn)在不能確定自己時(shí)間的同學(xué)不要填報(bào)，可以下次上課時(shí)再報(bào)。3.一旦填報(bào)就不能再更改時(shí)間。第66頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、無(wú)污染的氣、液相環(huán)境２、溫度３、生長(zhǎng)基質(zhì)O2CO2液相環(huán)境多聚賴氨酸纖維連接蛋白膠原層粘連蛋白親玻粘連蛋白韌粘素（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件第67頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、無(wú)污染的氣、液相環(huán)境體外培養(yǎng)技術(shù)特別強(qiáng)調(diào)無(wú)菌操作。組織取材、細(xì)胞分離、種植、傳代、孵育以及利用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)時(shí)，都必須在無(wú)污染環(huán)境下進(jìn)行；培養(yǎng)所用的各種器具、液體以及其它用品都需嚴(yán)格消毒滅菌，以保證培養(yǎng)物不被污染。在無(wú)污染的前提下，必須為培養(yǎng)物提供適宜其生存和生長(zhǎng)的氣、液相環(huán)境。（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件第68頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、無(wú)污染的氣、液相環(huán)境氣體環(huán)境是細(xì)胞生存的必要條件之一。供應(yīng)氣體的方式是向培養(yǎng)箱內(nèi)通入含有一定比例CO2的空氣。其中，與細(xì)胞生命活動(dòng)密切相關(guān)的氣體主要有O2和CO2。O2和CO2以氣體擴(kuò)散方式進(jìn)入培養(yǎng)液和培養(yǎng)物內(nèi)。O2(oxygen)參與細(xì)胞的能量代謝，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。CO2（carbondioxide）主要與維持培養(yǎng)液的酸堿度有直接關(guān)系。（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件第69頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、無(wú)污染的氣、液相環(huán)境體外細(xì)胞生長(zhǎng)的液相環(huán)境是各種平衡鹽溶液或培養(yǎng)液。水和無(wú)機(jī)鹽是其中最主要的成分，并由它們構(gòu)成溶液的滲透壓，也就是細(xì)胞膜外的滲透壓。在配制各種培養(yǎng)用液時(shí)，必須嚴(yán)格按照配方和配制方法的要求進(jìn)行，以保證溶液為等滲。（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件第70頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、無(wú)污染的氣、液相環(huán)境２、溫度３、生長(zhǎng)基質(zhì)O2CO2液相環(huán)境多聚賴氨酸纖維連接蛋白膠原層粘連蛋白親玻粘連蛋白韌粘素（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件第71頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天２、溫度無(wú)論來(lái)源于何種有機(jī)體的細(xì)胞培養(yǎng)都需要一個(gè)與體內(nèi)生存環(huán)境盡可能一致的生長(zhǎng)條件，其中最基本的條件之一是恒定的和適宜的溫度環(huán)境。人和哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度在35～37℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比對(duì)高溫強(qiáng)。（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件第72頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天高溫的影響：溫度上升不超過(guò)39℃時(shí)，細(xì)胞的代謝強(qiáng)度與溫度成正比。細(xì)胞在39～40℃中培養(yǎng)1h，即會(huì)受到一定損傷，但仍能恢復(fù)。當(dāng)在41～42℃的溫度條件下培養(yǎng)1h，細(xì)胞則會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p傷，但不致于全部死亡，部分仍可能恢復(fù)。當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時(shí)，細(xì)胞大多死亡。（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件２、溫度第73頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天低溫的影響：對(duì)于溫度低于正常范圍的環(huán)境，總的來(lái)說(shuō)，只要溫度不低于0℃時(shí)，低溫只能抑制細(xì)胞代謝，并無(wú)傷害作用。細(xì)胞在25～35℃條件下仍能生存和生長(zhǎng)，但速度緩慢。若將培養(yǎng)的細(xì)胞放在4℃下數(shù)小時(shí)后，再置37℃培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)良好地生長(zhǎng)。細(xì)胞代謝隨溫度降低而減緩。溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞胞漿結(jié)冰可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件２、溫度第74頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天１、無(wú)污染的氣、液相環(huán)境２、溫度３、生長(zhǎng)基質(zhì)O2CO2液相環(huán)境多聚賴氨酸纖維連接蛋白膠原層粘連蛋白親玻粘連蛋白韌粘素（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件第75頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天３、生長(zhǎng)基質(zhì)（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，除少數(shù)懸浮型生長(zhǎng)的細(xì)胞外，一般需要粘附于一固相表面才能生長(zhǎng)，這是由于在體外環(huán)境下，生存的細(xì)胞相互之間失去了在體內(nèi)生存時(shí)所依托的組織學(xué)關(guān)系，只有附著于培養(yǎng)器皿的壁上生長(zhǎng)。在很多情況下，培養(yǎng)器皿表面的材質(zhì)不太適合于某些生長(zhǎng)能力較差的細(xì)胞附著和生長(zhǎng)，因而采用在培養(yǎng)液中添加或在培養(yǎng)器皿表面包被生長(zhǎng)基質(zhì)物質(zhì)來(lái)幫助細(xì)胞黏附、貼壁和生長(zhǎng)。第76頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天在培養(yǎng)器皿表面包被的這層能改善生長(zhǎng)表面的特性、促進(jìn)細(xì)胞黏附和貼壁的物質(zhì)，即生長(zhǎng)基質(zhì)（growthsubstratum）。生長(zhǎng)基質(zhì)物質(zhì)主要是一些細(xì)胞外基質(zhì)成分。３、生長(zhǎng)基質(zhì)（五）細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的其它條件（1）多聚賴氨酸（poly-lysine）（2）纖維連接蛋白（fibronectin)（3）膠原（collagen）（4）層粘連蛋白（laminin，LN）（5）親玻粘連蛋白(vitronectin)（6）韌粘素（tenascins）主要包括：第77頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）清洗和消毒體外培養(yǎng)工作需要使用大量消耗性物品，包括玻璃器皿、金屬器械、塑料和橡膠制品以及布類紙類用品等培養(yǎng)用品。雖然很多在國(guó)外基本上都采用已消毒的一次性用品，但我國(guó)目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室因條件所限，一些培養(yǎng)用品仍在反復(fù)使用。因而體外培養(yǎng)中大量的工作是進(jìn)行清洗和消毒。另外，與體外培養(yǎng)工作有關(guān)的培養(yǎng)室場(chǎng)地、工作臺(tái)和培養(yǎng)液等也必須進(jìn)行嚴(yán)格消毒和滅菌。清洗和消毒的主要目的在于去除培養(yǎng)用品上對(duì)組織生長(zhǎng)有影響的各種雜質(zhì)以及消除附著在其上的各種微生物。清洗和消毒是否徹底直接關(guān)系到體外培養(yǎng)的成敗。操作者在培養(yǎng)工作中，要建立無(wú)菌觀念，掌握無(wú)菌技術(shù)，防止在任何環(huán)節(jié)上發(fā)生污染。第78頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)用具的清洗2、培養(yǎng)用具的消毒和滅菌玻璃器皿的清洗膠塞和塑料用品的清洗清洗后物品的包裝物理方法化學(xué)方法紫外線消毒壓力蒸汽滅菌高溫干熱滅菌過(guò)濾除菌電離輻射滅菌甲醛、環(huán)氧乙烷乙醇、氯已定戊二醛、碘伏與碘酊抗生素（六）清洗和消毒第79頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)用具的清洗（六）清洗和消毒（1）玻璃器皿的清洗：玻璃器皿的清洗一般需經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸和沖洗等四個(gè)步驟。第80頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)用具的清洗（六）清洗和消毒（1）玻璃器皿的清洗：應(yīng)以防酸、耐熱、開口較大的容器盛清潔液。可選用塑料制品或玻璃制品。配制清潔液方法如下：1）按照上述配方，將需要量的重鉻酸鉀和水加到選用的容器內(nèi)。2)向容器內(nèi)緩慢、分次加入濃硫酸（工業(yè)用即可）。可輕緩攪拌溶液，以加快散熱及使重鉻酸鉀溶解。加入濃硫酸切忌過(guò)急，以免液體驟熱，發(fā)生危險(xiǎn)。3)自然冷卻。清潔液的配制：第81頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天新配制的清潔液呈棕紅色。配制清潔液和浸酸時(shí)，操作者須戴耐酸手套等。浸酸的器皿一定要涼干，以免將水分帶入清潔液而使其效力下降。放入器皿或浸酸后拿出器皿時(shí)，須小心操作，防止液體濺出，傷及皮膚和衣服。將器皿從清潔液中拿出時(shí)，應(yīng)滴干清潔液。當(dāng)清潔液的顏色變暗、發(fā)綠或混濁時(shí)，說(shuō)明使用過(guò)久，效力降低，應(yīng)重新配制。1、培養(yǎng)用具的清洗（六）清洗和消毒（1）玻璃器皿的清洗：清潔液的配制：第82頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)用具的清洗（六）清洗和消毒（2）膠塞和塑料用品的清洗：使用后的膠塞要先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10min.，自來(lái)水沖洗晾干后，再用1%稀鹽酸浸泡30min。最后分別用自來(lái)水和雙蒸水各沖洗3次，烘干備用。塑料器皿在使用后也要及時(shí)在水中浸泡。自來(lái)水沖洗干凈。一般不用刷洗以防劃痕和損傷。洗干凈的器皿先在2%NaOH溶液中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗，再經(jīng)1％稀鹽酸浸泡30min.，最后分別用自來(lái)水和雙蒸水沖洗3次。烘干備用。第83頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)用具的清洗（六）清洗和消毒（3）清洗后物品的包裝：洗凈烘（晾）干的培養(yǎng)物品應(yīng)及時(shí)包裝，以備消毒滅菌。包裝的物品便于消毒和貯存，同時(shí)可防止消毒滅菌后再受污染。包裝常用牛皮紙、硫酸紙、紗布、平紋棉布、鋁盒、搪瓷杯、專用金屬消毒筒等。包裝的方式可根據(jù)消毒滅菌的方法而有所不同：對(duì)于體積較大的瓶皿（如大燒杯、燒瓶）及濾器等其它容器，可進(jìn)行局部包裝。對(duì)于體積較小的培養(yǎng)用品如培養(yǎng)皿、吸管、注射器、金屬器械、膠塞及棉球等可以先裝入鋁飯盒、搪瓷杯或消毒筒等容器中，然后再用平紋布全部包裹起來(lái)。第84頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)用具的清洗2、培養(yǎng)用具的消毒和滅菌玻璃器皿的清洗膠塞和塑料用品的清洗清洗后物品的包裝物理方法化學(xué)方法紫外線消毒壓力蒸汽滅菌高溫干熱滅菌過(guò)濾除菌電離輻射滅菌甲醛、環(huán)氧乙烷乙醇、氯已定戊二醛、碘伏與碘酊抗生素（六）清洗和消毒第85頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）清洗和消毒2、培養(yǎng)用具的消毒和滅菌（1）物理方法：常用物品的消毒方法：第86頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）清洗和消毒2、培養(yǎng)用具的消毒和滅菌（1）物理方法：1）紫外線消毒（disinfectionbyultravioletlight）紫外線（ultraviolet）是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物：其中以革蘭氏陰性菌最為敏感；其次是革蘭氏陽(yáng)性菌，如金黃色葡萄球菌等；再次為芽孢；真菌孢子的抵抗力最強(qiáng)。紫外線的作用機(jī)制是通過(guò)對(duì)微生物核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活的。目前多用紫外線燈直接照射培養(yǎng)室內(nèi)空氣、地面、工作臺(tái)表面等進(jìn)行消毒。其用法簡(jiǎn)便，效果好。第87頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）清洗和消毒2、培養(yǎng)用具的消毒和滅菌（1）物理方法：2）壓力蒸汽滅菌（pressuresteamsterilization）壓力蒸汽滅菌是目前最常用的一種滅菌方法。其通過(guò)高溫高壓及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。布類衣物、玻璃器皿、金屬器械、膠塞和某些培養(yǎng)用液等都可應(yīng)用這一方法。第88頁(yè),共97頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）清洗和消毒2、培養(yǎng)用具的消毒和滅菌（1）物理方法：3）高溫干熱滅菌（dryheatsterilization）體外培養(yǎng)中的干熱滅菌主要是用電熱烤箱內(nèi)160℃以上的高熱，并保持90～120min，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的方法。主要用于不便