蜱種鑒定技術(shù)規(guī)范

1常見(jiàn)蜱種鑒定技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了常見(jiàn)的5種蜱，即長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalislongicornis）、嗜群血蜱（(Haemaphysalisconcinna）、日本血蜱（Haemaphysalisjaponica）、森林革蜱（Dermacentorsilvarum）、全溝硬蜱（Ixodespersulcatus）的采集、保存、形態(tài)學(xué)鑒定以及DNA條形碼鑒定技術(shù)。本文件適用于蜱的種類鑒定，可輔助應(yīng)用于相關(guān)蜱傳病的監(jiān)測(cè)與防控。其中形態(tài)學(xué)鑒定最適用于形態(tài)完整且未飽血的成蜱；DNA條形碼技術(shù)適用于任何形態(tài)及不同發(fā)育階段的蜱，包括殘損蜱、飽血蜱、幼蜱、若蜱、成蜱、蜱卵。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T36788-2018，病媒生物密度監(jiān)測(cè)方法—蜱類，2019SN/T5337—2021，動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，20223術(shù)語(yǔ)和定義環(huán)境游離蜱：在經(jīng)常放牧的草地、野生動(dòng)物巢穴及家養(yǎng)畜舍地面采集到的蜱。滅菌雙蒸水：經(jīng)過(guò)一次蒸餾后的水，再次蒸餾，并在103.4kPa，121℃的條件下高壓蒸汽滅菌20min，得到滅菌雙蒸水。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。COI:細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（CytochromeCoxidasesubunitI）DNA:脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）SDS:十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate）5樣品采集5.1試劑與材料5.1.2白絨布5.1.375%和95%乙醇。5.1.4乳膠手套。5.1.515mL和50mL離心管。25.2采集方法5.2.1采集人員防護(hù)要求穿淺色、表面光滑的長(zhǎng)袖防護(hù)服，扎緊袖口和褲腿，穿雨靴，戴乳膠手套。裸露皮膚涂抹趨避劑如避蚊胺等。用殺蟲(chóng)劑浸泡帳篷等露營(yíng)裝備。避免在蜱棲息地如草地、樹(shù)林等環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間坐臥。野外活動(dòng)結(jié)束后檢查衣物上是否有蜱。采集人員需及時(shí)進(jìn)行沖淋洗浴，并檢查體表，重點(diǎn)排查頭發(fā)、腋窩、腹股溝及陰部等位置是否有蜱叮咬或爬動(dòng)。一旦發(fā)現(xiàn)蜱叮咬，用鑷子從叮咬處夾住蜱，順著叮咬方向小心取出，用碘伏或酒精反復(fù)擦洗傷口；如蜱的假頭基留在皮膚內(nèi)，用潔凈的針頭挑破傷口皮膚，挑出假頭基，再用碘伏或酒精反復(fù)擦洗。保留蜱，置于離心管或其他密閉容器內(nèi)4℃暫放，特別是在蜱傳病流行的地區(qū)，需盡快就醫(yī)。5.2.2畜禽體上蜱的采集在牛、羊、犬、禽等動(dòng)物身上采集蜱時(shí)，用干凈、尖細(xì)的鑷子靠近皮膚表面緩慢夾取蜱，避免蜱的假頭基部分殘留在皮膚內(nèi)。將采集到的蜱放置到15mL或50mL離心管中。去除蜱后，用75%乙醇溶液對(duì)被蜱叮咬處進(jìn)行消毒。5.2.3環(huán)境游離蜱的采集布旗采集法：白絨布一邊穿入木棍，在木棍兩端系以長(zhǎng)繩，選擇在人和動(dòng)物經(jīng)?；顒?dòng)的小路周邊草地上或灌木叢中緩慢拖動(dòng)，草地以及灌木上的蜱即可附著在旗面上。每行走約5米左右，即停下檢查旗背面是否有蜱附著，并用鑷子收集于離心管中直接采集法：在稍矮的草地，將身體稍下蹲貼近地面，輕輕扶起草葉，觀察草葉背面是否有蜱；在稍高的草地，直接觀察草尖處。發(fā)現(xiàn)蜱后用鑷子收集于離心管中或?qū)⑷~子截?cái)噙B同蜱共同置入離心管內(nèi)，盡快赴實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行處置。5.2.4衣物及布旗的處理無(wú)需重復(fù)使用的物品，采用焚燒、煮沸或高溫蒸汽的方法處理；需要重復(fù)使用的物品，如個(gè)人衣物、布旗等，采用煮沸法、高溫蒸汽法或洗衣機(jī)的高溫烘干功能進(jìn)行處理。5.3蜱樣本的運(yùn)輸及保存在車輛運(yùn)輸過(guò)程中需置于4-8℃車載冰箱。5.3.2保存用于蜱種鑒定的蜱樣本置于離心管內(nèi)，并加入足量的95%的乙醇溶液或無(wú)水乙醇浸泡，定期補(bǔ)充乙醇。容器上需附有采集標(biāo)簽，注明采集地點(diǎn)、日期、宿主、生境、海拔、經(jīng)緯度、采集人等信息，避光陰涼處暫放，避免高溫與陽(yáng)光直射。暫時(shí)保存需將完整的蜱置于4℃、適當(dāng)濕度、避光環(huán)境下，可暫存2周以上。長(zhǎng)期保存則需液氮冷凍1小時(shí)以上之后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存。6形態(tài)學(xué)鑒定36.1試劑與材料參照SN/T5337—2021動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，20226.2設(shè)備與儀器體視顯微鏡。6.3形態(tài)學(xué)觀察參照SN/T5337—2021動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，2022蜱具體形態(tài)特征部位參見(jiàn)附錄B。6.4蜱的形態(tài)學(xué)種類判定蜱可根據(jù)典型形態(tài)特征鑒定到屬和種，具體形態(tài)特征按照附錄C進(jìn)行鑒定，其他不易觀察到典型形態(tài)特征或殘缺的蜱則需采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行種類的鑒定。7DNA條形碼鑒定7.1試劑與材料除特別說(shuō)明以外，本文件所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)符合規(guī)范性引用文件的規(guī)定。7.1.1無(wú)水乙醇。7.1.2滅菌雙蒸水，按照附錄A.2配制。7.1.31.5mL離心管。7.1.4研磨管。7.1.5蛋白酶K7.1.6三羥甲基基甲烷（Tris）7.1.7TaqDNA聚合酶及dNTP7.1.8瓊脂糖及溴化乙錠（EB）7.1.9乙二胺四乙酸鈉（Na2EDTA）7.1.10苯酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇等7.1.11電泳緩沖液TBE，按照附錄A.3配制。7.1.1250×TAE7.1.13GoldVIEWⅠ核酸熒光染色劑。7.1.1416SrDNA或COI引物任選其一。7.1.151.5%瓊脂糖凝膠，按照附錄A.4配制。擴(kuò)增片段引物序列（5’-3’）片段大小（bp）16SrDNAF-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGGR-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGTF-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG460COIR-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA7104用雙蒸水將引物稀釋為20μmol/L工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。引物合成后采用滅菌雙蒸水稀釋為7.2設(shè)備與儀器7.2.1常規(guī)PCR儀。7.2.2組織研磨器。7.2.3超凈工作臺(tái)。7.2.4制冰機(jī)。7.2.5恒溫水浴鍋。7.2.6高速冷凍離心機(jī)。7.2.7常規(guī)冰箱。7.2.8旋渦振蕩器。7.2.9電泳儀。7.2.10凝膠成像系統(tǒng)。7.2.1110μL、100μL、1000μL的微量可調(diào)移液器及配套吸頭。7.2.12水平電泳槽。7.2.13紫外分光光度計(jì)。7.2.14高壓滅菌鍋。7.3檢測(cè)方法7.3.1樣本的處理及核酸提取使用完整或不完整的成年蜱、幼蜱、若蜱、蜱卵樣品。將蜱樣品放置于1.5mL除酶離心管中，先用300μL無(wú)水乙醇沖洗2次，再用300μL滅菌雙蒸水沖洗2次，放入一個(gè)新的研磨管中，管內(nèi)加入6-8顆研磨珠，再加入200μL滅菌雙蒸水，將研磨管放入組織研磨器中，12000r研磨5min，用移液器吸取200μL研磨液的上清液，按照附錄E提取組織DNA的方法,也可采用商品化的組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。7.3.2PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分體積(μL）MasterMix(DyePlus)5上游引物（10μM）0.3下游引物（10μM）0.3雙蒸水3.4蜱組織DNA1總體積7.3.3PCR擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；54℃退火30s；72℃延伸50s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min。PCR陽(yáng)性對(duì)照：蜱基因組DNA，參照附錄A.1。PCR空白對(duì)照：滅菌雙蒸水。57.3.4瓊脂糖凝膠電泳取5-10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳（附錄A.3）。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀或者紫外透射儀觀察結(jié)果。7.3.5結(jié)果判定核酸電泳判定16SrDNA陽(yáng)性對(duì)照，有460bp的擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照沒(méi)有相應(yīng)條帶，判定試驗(yàn)成立；否則試驗(yàn)無(wú)效，需分析并排除引起試驗(yàn)無(wú)效的因素，并重新試驗(yàn)。COⅠ基因陽(yáng)性對(duì)照，有710bp的擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照沒(méi)有相應(yīng)條帶，判定試驗(yàn)成立；否則試驗(yàn)無(wú)效，需分析并排除引起試驗(yàn)無(wú)效的因素，并重新試驗(yàn)。在陽(yáng)性、陰性對(duì)照都成立的前提下，若檢測(cè)樣品有460/670bp的條帶，則試驗(yàn)陽(yáng)性；若檢測(cè)樣品無(wú)460/670bp條帶，則試驗(yàn)陰性。核酸測(cè)序取16SrDNA基因或COⅠ基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)分析將PCR擴(kuò)增后測(cè)序的COI序列或16S序列，登錄數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析，以分值最高且序列相似度≥97%的蜱種為鑒定結(jié)果。8結(jié)果綜合判定8.1典型形態(tài)特征的樣品，直接判定蜱種。8.2缺乏典型形態(tài)特征或部分典型特征的樣品，結(jié)合分子生物學(xué)DNA條形碼方法結(jié)果進(jìn)行蜱種鑒6（規(guī)范性）試劑的配制A.1陽(yáng)性對(duì)照取蜱（成蜱、若蜱、幼蜱、卵）等，提取基因組DNA，使用50μL滅菌雙蒸水溶解或洗脫基因組DNA，-80℃保存。A.2滅菌雙蒸水經(jīng)過(guò)一次蒸餾后的水，再次蒸餾，并在103.4kPa，121℃條件下高壓蒸汽滅菌20min，得到滅菌雙蒸水。A.3電泳緩沖液TBE即濃貯存液5×TBETris堿54.0g硼酸0.5MEDTA20mL在pH＝8.0條件下，加蒸餾水定容至1L，工作液為稀釋的0.5×TBEA.41×TAE緩沖液及1.5%瓊脂糖凝膠50×TAE緩沖液蒸餾水490mL1×TAE緩沖液瓊脂糖核酸染料將三角瓶放在沸水浴中加熱至瓊脂糖充分溶解，置室溫冷卻到50℃左右，加入核酸染料5μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后，4℃?zhèn)溆谩?（資料性）主要蜱種的基本信息、典型形態(tài)圖及基本生物學(xué)特征B.1主要蜱種的形態(tài)模式圖蜱隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda），蛛形綱（Arachnida），蜱螨亞綱（Acarina）、寄螨目（Parasitiformes）、蜱總科（Ixodoidea），包括硬蜱科、軟蜱科及納蜱科，常見(jiàn)蜱種為硬蜱（暫未發(fā)現(xiàn)軟蜱和納蜱）。（形態(tài)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖B1）B.2主要蜱種的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)蜱背腹扁平，圓形或者橢圓形，身體分為假頭和軀體兩部分，假頭突出于軀體前或者位于軀體腹面前端，為口器部分。軀體腹部有4對(duì)足。蜱的軀體背腹面是否有幾丁質(zhì)的盾板及盾板形狀等是鑒別蜱種的重要特征。蜱的發(fā)育為不全變態(tài)，包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱四個(gè)階段，幼蜱只有3對(duì)足。B.3主要蜱種的寄生部位8蜱通常寄生在動(dòng)物耳部、腳趾間、腋窩處、頸項(xiàng)部、陰部及肛門(mén)等皮膚較薄、不易被搔動(dòng)的部位，寄生數(shù)量多時(shí)蜱在動(dòng)物全身可見(jiàn)。B.4蜱種的主要宿主動(dòng)物蜱是重要的吸血性外寄生蟲(chóng)，在蛻皮等發(fā)育時(shí)需要附著于宿主體表吸血。主要寄生在哺乳動(dòng)物體表，少數(shù)寄生在鳥(niǎo)類、爬行類及兩棲類體表。蜱在叮咬宿主、吸食血液的同時(shí)釋放毒素，可導(dǎo)致癱瘓、毒性反應(yīng)以及宿主的過(guò)敏反應(yīng)等。B.5主要蜱種可導(dǎo)致的人獸共患病與動(dòng)物疫病蜱作為媒介可傳播、攜帶多種人畜共患病以及動(dòng)物疫病。蜱傳播的疾病主要有：Q熱、立克次體病、萊姆病、森林腦炎、克里米亞-剛果出血熱、人粒細(xì)胞無(wú)形體病、兔熱病、牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病等。9（規(guī)范性）蜱科屬的形態(tài)學(xué)鑒定步驟C.1蜱科的確定（科檢索表）鑒定步驟鑒定特征鑒定結(jié)果1身體背面具幾丁質(zhì)盾板或假盾區(qū)；假頭向前，從背面可見(jiàn)；氣門(mén)板顯著，位于身體腹面，足基節(jié)Ⅳ的后外側(cè)；須肢各節(jié)幾乎等長(zhǎng)，或第Ⅳ節(jié)收縮，內(nèi)陷于第Ⅲ節(jié)腔內(nèi)。進(jìn)行步驟2表皮革質(zhì)，身體背面無(wú)盾板（原偽盾蜱屬的種類具革質(zhì)假盾區(qū)，但硬化程度不高）；假頭位于腹面前方，若蜱和成蜱從背面不可見(jiàn)；氣門(mén)板不明顯，位于足基節(jié)Ⅲ和Ⅳ之間的基節(jié)上褶上；須肢各節(jié)幾乎等長(zhǎng)，第Ⅳ節(jié)不收縮，不內(nèi)陷，不近端點(diǎn)。軟蜱科（Argasidae）2雌蜱身體背面具皺褶；前端具乳突狀革質(zhì)假盾區(qū)，覆蓋物褶疊程度深；須肢3節(jié)，末節(jié)內(nèi)陷不明顯。納蜱科（Nuttalliellidae）身體背面具明顯堅(jiān)硬的盾板，雌蜱和未成熟蜱覆蓋背面前半部，雄蜱則覆蓋整個(gè)背部；除幾丁質(zhì)板附近，表皮上具有細(xì)小的褶或條紋；須肢第Ⅰ節(jié)收縮，內(nèi)陷在第Ⅲ節(jié)腔內(nèi)。硬蜱科（Ixodidae）C.2硬蜱科各屬的確定（屬檢索表）鑒定步驟鑒別特征鑒定結(jié)果1肛溝圍繞在肛門(mén)之前；無(wú)眼；雄蜱腹面幾乎全部被幾丁質(zhì)板覆蓋（共7塊）；幼蜱口下板后毛2對(duì)，背部無(wú)矢狀感器；通常為巢居性寄生，宿主不具專一性；雄蜱不吸血，分布廣泛。硬蜱屬（Ixodes）肛溝圍繞在肛門(mén)之后，通常很??；眼有或無(wú)；雄蜱腹面無(wú)幾丁質(zhì)板，或發(fā)育不完全，僅分布在身體后端（肛側(cè)板和副肛側(cè)板）；幼蜱僅1對(duì)口下板后毛，身體背部具矢狀感器；通常不穴居或巢居；雄蜱吸血，分布相對(duì)有地域性。無(wú)眼（尤其成蜱和若蜱）進(jìn)行步驟2有眼進(jìn)行步驟32假頭基方形至矩形；須肢短，呈圓錐形，第II節(jié)長(zhǎng)寬約等，其外側(cè)超出假頭基邊緣；幼蜱須肢3節(jié)，其背面矢狀感器前端具2對(duì)緣毛；宿主不具專一性。血蜱屬（Haemaphysalis）3氣門(mén)板正常，無(wú)脊或色斑；緣垛有或無(wú)，但不是9個(gè)，須肢長(zhǎng)度近似等于假頭基，且第II節(jié)長(zhǎng)與寬大致相等，有緣垛，雄蜱的第IV對(duì)足正常，假頭基矩形，通常有色斑。革蜱屬（Dermacentor）注：目前內(nèi)，主要硬蜱科成員為全溝硬蜱，革蜱屬成員為森林革蜱，血蜱屬成員為長(zhǎng)角血蜱、嗜群血蜱、日本血蜱。（規(guī)范性）主要蜱種形態(tài)鑒別特征D.1主要蜱種形態(tài)鑒別特征蜱屬蜱種血蜱屬長(zhǎng)角血蜱日本血蜱革蜱屬森林革蜱的距，內(nèi)距較尖窄，基節(jié)IV外距的末端的距，內(nèi)距較為尖窄，基節(jié)IV外距不超硬蜱屬后內(nèi)角窄小如距突；基節(jié)IV有短的外距1（規(guī)范性）樣品DNA的抽提E.1加入60μL10％SDS溶液，10μL20mg/mL蛋白酶K，溫和混勻，37℃溫育1h。E.2加入100μL5mol/L的NaCl溶液，上下顛倒離心管十多次，充分混勻。E.3加入80μLCTAB/NaCl溶液，溫和混勻，65℃溫育10min。E.4加入700μL氯仿/異戊醇，溫和混勻，12000rpm/min離速離心2min。E.5吸取上清液至另一干凈離心管，加入等體積的酚或氯仿或異戊醇，上下顛倒混勻，12000rpm/min高速離心2min。E.6吸取上清液至另一干凈離心管，加入2倍體積冰冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA，溫和混勻。E.7在12000rpm/min，30min，4℃條件下離心，徹底去除上清液。E.8用300μL70％預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，在12000rpm/min，15min，4℃條件下離心，棄上清液，再離心10秒，用移液器徹底除去酒精，風(fēng)干。E.9沉淀溶于100μLTE溶液中。-20℃保存。E.10或者采用等效的DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。2參考文獻(xiàn)[1]GB/T36788-2018，病媒生物密度監(jiān)測(cè)方法—蜱類，2019[2]SN/T5337-2021，動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，2021[3]李朝品，蜱螨與人類疾病.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，1995[4]李朝品，醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué).人民軍醫(yī)出版社，2006[5]劉敬澤，蜱類學(xué).中國(guó)林業(yè)出版社，2003[6]陳澤，蜱的系統(tǒng)分類學(xué).科學(xué)出版社，2